siRNA沉默Nox1基因抑制胃癌细胞的生长*

辛 林，曹家庆，朱培谦，沈 威，毛盛勋

(南昌大学第二附属医院胃肠外科，江西 南昌 330006)

胃癌是胃肠道常见的恶性肿瘤，细胞癌基因、凋亡抑制基因、凋亡基因等的异常表达是胃癌产生的重要原因。因此，特异性阻止胃癌细胞内异常高表达基因已成为胃癌治疗的新方法［1］。近年来研究表明，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是参与体内细胞分化、增殖、转化、凋亡以及血管生成调节的重要信号分子［2］。细胞内ROS主要是由NADPH氧化酶(NADPH oxidase，Nox)调控生成，有学者报道Nox1在人正常胃上皮组织中不表达，但在胃癌组织中高表达［3］。因此，Nox1基因有可能成为胃癌生物治疗的分子靶点。

RNA干扰(RNA interfering，RNAi)是近年来发展起来的一种基因沉寂技术，已成为分子生物学研究中最为活跃的热点之一。RNAi技术可高效、特异地下调靶基因的表达，是一种简便而快速的基因功能研究手段［4，5］。本实验使用RNA干扰技术抑制胃癌细胞Nox1基因的表达，研究Nox1基因与胃癌细胞凋亡的关系，期望为胃癌的基因治疗提供一定的实验依据。

材料和方法

1 材料

人胃癌细胞株SGC－7901由上海消化外科研究所提供。siRNA序列由上海吉玛制药有限公司合成。Nox1 siRNA正义链序列为5'－CCU GAG GGG CAC CUG CUC A dTdT－3'，反义链序列为5'－UGA GCA GGU GCC CCU CAGG dTdT－3'。阴性对照siRNA正义链序列为5'－UUC UCC GAA CGU GUC ACG U dTdT－3'，反义链序列为5'－ACG UGA CAC GUU CGG AGA A dTdT－3'。RNA抽提试剂盒购自Invitrogen，逆转录试剂盒购于Promega。实时定量PCR所用的荧光标记物SYBR Green I混合物购自Applied Biosystems，所用引物采用Primer Express软件(Applied Biosystem)设计，鼠抗人Nox1单克隆抗体和Annexin V－异硫氰酸荧光素(FITC)凋亡检测试剂盒购自 BD Transduction Laboratories，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠II抗购自Santa Cruz。

2 方法

2.1 细胞培养 在37℃、5%CO2(V/V)饱和湿度条件下，含10% 胎牛血清的RPMI－1640培养液中传代培养人胃癌SGC－7901细胞。转染前1 d，换取新鲜培养液后调整细胞浓度为5×107/L，以每孔2 mL接种于6孔板中培养过夜，待细胞增殖至50%～70%时，根据实验要求换为新鲜配制的含不同siRNA的RPMI－1640培养液，继续培养1～5 d后检测各指标。

2.2 细胞转染 转染试剂采用Lipofectamine2000(Life Technology)，按说明书操作，简述如下:每500μL终体积中加入siRNA 母液1.5μL(干扰浓度为60 nmol/L)与50 μL RPMI－1640 培养液混合，Lipofectamine 20001.2 μL与 RMPI－1640培养液50 μL混合，室温放置5 min(Lipofectamine 2000与siRNA比例为1∶3)，将上述用RPMI－1640稀释的siRNA和Lipofectamine 2000混合，室温放置20 min。将此混合物加入细胞培养板(预先加入 RPMI－1640培养液400 μL)，混匀，37℃、5%CO2培养4 h后换用新鲜含10%新生牛血清的RPMI－1640培养液继续培养。实验分为4组:空白对照组(正常培养细胞)、阴性对照组(加阴性对照siRNA)、试剂对照组(不加siRNA，仅加入转染试剂)和干扰组(加入Nox1特异性的siRNA)。

2.3 实时定量PCR检测胃癌SGC－7901细胞Nox1 mRNA表达 用Trizol提取细胞中总RNA，将1 μg总RNA逆转录成cDNA。用Nox1实时定量PCR引物进行荧光定量PCR检测。Nox1上游引物:5'－CTC TCT CCT GGA ATG GCA TC－3'，下游引物 5'－TGG AAA ACA TCC TCA CTG GC－3'。采用GAPDH作为内参照，上游引物:5'－GGA CCT GAC CTG CCG TCT AG －3'，下游引物 5'－ GTAGCC CAG GAT GCC CTT GA－3'。采用实时定量PCR仪(MJ Research)扩增上述基因，PCR 反应体系为:cDNA 1.0 μL，2 × SYBR Green I混合物 10 μL，上、下游引物各 1.0 μL，ddH2O 7.0 μL，每一样品均重复2个反应。按下述条件进行反应:50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，58℃ 1 min，40个循环。采用GAPDH内参照，Nox1 mRNA和GAPDH mRNA根据标准曲线得出mRNA的分子拷贝数。用GAPDH的拷贝数作为校正基数，即目的基因mRNA含量=目的基因Ct值/内参照GAPDH Ct值，以此比值做统计处理。根据FQ－PCR原理，被激发的荧光信号达到一定阈值后被荧光探头采集，最后将其转换成Ct值，该数值与扩增片段的实际拷贝数呈反比，即Ct值越低，实际拷贝数含量越高。

2.4 Western blotting检测胃癌SGC－7901细胞Nox1蛋白表达 取转染72 h后的胃癌SGC－7901细胞总蛋白50μg做SDS－PAGE电泳。电泳结束后转移蛋白至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入 Nox1鼠抗人多克隆抗体(1∶500)及GAPDH鼠抗人多克隆抗体(1∶500)室温孵育3 h，TBST洗膜，加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠多克隆Ⅱ抗(1∶2000)1 h，TBST洗膜，用DAB显色。经自动电泳凝胶分析系统扫描并测定杂交条带IA，实验重复3次，将Nox1 IA/GAPDH IA平均值作为其蛋白表达水平的相对值。

2.5 CCK8细胞增殖实验 胃癌SGC－7901细胞培养于96孔板，2×103cells/well，实验分为4组:空白对照组(正常培养细胞)，阴性对照组(加阴性对照siRNA)，试剂对照组(不加siRNA，仅加入转染试剂)和干扰组(加入Nox1特异性的siRNA)，每种处理方式接种5复孔，24 h后细胞处于指数生长阶段转染 Nox1 siRNA，分别在转染后24、48、72、96 h、120 h 加入 CCK810 μL，37 ℃ 培育4 h，酶标仪(Bio－TEK ，型号Quant)检测其450 nm的吸光度(A)，取5个时点的A值平均值并绘制生长曲线。

2.6 细胞凋亡检测 细胞制成1×108/L的悬液，取100 μL细胞悬液放入试管中，加入 FITC－Annexin V 10 μL和 PI 5 μL染色，室温下避光静置15 min后加400 μL孵育缓冲液，1 h内流式细胞仪检测。先通过散射光信号分选细胞与细胞碎片，然后再在双变量荧光信号散点图上区分出活细胞、死亡细胞与凋亡细胞。

3 统计学处理

结 果

1 Nox1 siRNA对胃癌细胞Nox1 mRNA和相应蛋白表达水平的影响

将Nox1 siRNA转染至胃癌SGC－7901细胞，24、48及72 h后抽提其RNA，逆转录，经荧光定量PCR检测，发现转染24 h后干扰组细胞Nox1 mRNA表达量开始下降，与阴性对照组之间差异显著(P＜0.05)，48 h时下降更为明显，与阴性对照组之间差异显著(P＜0.01)，见图1。转染72 h后抽提蛋白，经Western blotting检测发现，干扰组细胞Nox1蛋白表达水平较阴性对照组下降明显，蛋白表达量是阴性对照组的17.55%，其抑制率为82.45%，与阴性对照组比较，显著差异(P ＜0.01)，见图2。

2 Nox1 siRNA对胃癌细胞生长的影响

Nox1 siRNA转染胃癌SGC－7901细胞72 h后干扰组胃癌细胞的增殖速度较阴性对照组、空白组及试剂对照组有显著下降(P＜0.05)，而阴性对照组与空白组及试剂对照组间无显著差异(P＞0.05)，见图3。

3 流式细胞术检测Nox1 siRNA对胃癌细胞凋亡的影响

Nox1基因沉默72 h后，经Annexin V/PI双染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率，空白对照、阴性对照、试剂对照和干扰组的凋亡率分别为(6.45±0.58)%、(8.16±1.03)%、(9.15±0.80)%和(53.44±3.40)%。干扰组细胞凋亡率较阴性对照组、空白对照组及试剂对照组有明显上升，差异显著(P ＜0.01)，见图4。

Figure 1.Real－time quantitative PCR results of Nox1 mRNA expression in SGC－7901 cells treated with Nox1 siRNA for 24，48 and 72 h..n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.05 vs negative control or reagent control group.图1 siRNA抑制SGC－7901细胞 Nox1 mRNA表达的实时定量PCR结果

Figure 2.Nox1 protein expression in SGC －7901 cells treated by Nox1 siRNA for 72 h..n=4.＊＊P＜0.01 vs negative control or reagent control group.图2 Nox1 siRNA抑制SGC－7901细胞Nox1蛋白的表达

Figure 3.The growth curves of SGC－7901 cell after Nox1 siRNA transfection..n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs negative control or reagent control group.图3 转染Nox1 siRNA后胃癌SGC－7901细胞生长的变化

Figure 4.SGC－7901 cell apoptotic rate in different groups after Nox1 siRNA transfection for 72 h..n=4.＊＊P＜0.01 vs negative control or reagent control group.图4 转染Nox1 siRNA 72 h后不同处理组SGC－7901细胞凋亡率比较

讨 论

Nox首先被发现于中性粒细胞和巨噬细胞中，在炎症反应时这两种细胞发生“氧化爆发”产生大量ROS而构成机体抵抗病原体的第一防线，与吞噬细胞中Nox所制造的ROS不同，其它细胞内Nox产生的ROS并非主要起细胞防御作用，而是作为第二信使，参与细胞分化、增殖、凋亡的调节［6］。在不同种类的细胞中发现了一系列NADPH氧化酶的催化亚基，分别称其为 Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5、DUOX1 及DUOX2，这些同源物后来被命名为Nox蛋白家族。有学者研究了Nox家族各个成员在多个肿瘤细胞系以及肿瘤组织及癌旁组织中的表达，发现在不同的肿瘤组织中，Nox家族各个成员表达的程度不同，Nox活性与肿瘤细胞的侵袭力及增殖能力相关［7］。

Nox1基因位于X染色体上，其至少有3种剪切变构体(splice variants)，即 Nox1α(外显子 1 ～13)、Nox1β(外显子1 ～10，12，13)、Nox1γ(外显子 1 ～5，14)。选择性地剪接掉Nox1外显子11，则不能编码蛋白产生超氧化物。正常组织中Nox1主要在结肠中有低表达，血管平滑肌中、子宫、前列腺、破骨细胞、视网膜细胞也有微弱表达［8］。研究发现，很多肿瘤或者转化细胞系中都可以检测到 Nox1的高表达［9，10］。Nox1可以通过产生ROS来增加肿瘤细胞抵抗凋亡的能力从而促进肿瘤细胞生长［11］。最近有学者报道Nox1活性的高低与结肠癌细胞侵袭和转移能力有关［12］。因此，Nox1基因可以成为抑制肿瘤生长的分子靶点［13］。研究证明Nox1基因在人胃正常上皮黏膜细胞、慢性萎缩性胃炎、胃腺瘤及胃癌周围组织中表达水平较低，而在胃的肠型及弥漫型腺癌，包括印戒细胞癌中有高表达，表达Nox1的胃癌组织同时具有胃型和肠型两种表型，因此，Nox1在胃癌的发生、发展中起着重要作用［14］。

本实验设计构建了针对Nox1基因的siRNA并将其导入胃癌细胞株SGC－7901中，观察siRNA对Nox1基因表达的影响以及Nox1过度表达被抑制后胃癌细胞生长活性的变化，明确Nox1基因在胃癌发生、发展中的作用以及与胃癌细胞生存的关系。本实验的结果证实，Nox1 siRNA可在mRNA及蛋白质水平上显著抑制Nox1基因表达，胃癌细胞转染Nox1 siRNA后其生长受到明显抑制并出现大量凋亡。研究结果初步显示利用RNA干扰技术阻断胃癌Nox1基因的异常高表达可以诱导胃癌细胞凋亡、抑制胃癌细胞的生长，Nox1基因是胃癌生物治疗的一个新靶点。

［1］Oh YK，Park TG.siRNA delivery systems for cancer treatment［J］.Adv Drug Deliv Rev，2009，61(10):850－862.

［2］Touyz RM，Briones AM，Sedeek M，et al.NOX isoforms and reactive oxygen species in vascular health［J］.Mol Interv，2011，11(1):27－35.

［3］Rokutan K，Kawahara T，Kuwano Y，et al.NADPH oxidases in the gastrointestinal tract:a potential role of Nox1 in innate immune response and carcinogenesis［J］.Antioxid Redox Signal，2006，8(9 －10):1573 －1582.

［4］刘 洁，沈文静，卢 瑶，等.小干扰RNA沉默hPTTG1基因对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响［J］.中国病理生理杂志，2011，27(1):102－107.

［5］郭 亚，赵能江，林 玲，等.notch1基因对人胶质瘤U251细胞增殖和周期的影响［J］.中国病理生理杂志，2010，26(6):1115 －1119.

［6］Peshavariya H，Dusting GJ，Jiang F，et al.NADPH oxidase isoform selective regulation of endothelial cell proliferation and survival［J］.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2009，380(2):193 － 204.

［7］Juhasz A，Ge Y，Markel S，et al.Expression of NADPH oxidase homologues and accessory genes in human cancer cell lines，tumours and adjacent normal tissues［J］.Free Radic Res，2009，43(6):523－532.

［8］Coant N，Ben Mkaddem S，Pedruzzi E，et al.NADPH oxidase 1 modulates WNT and NOTCH1 signaling to control the fate of proliferative progenitor cells in the colon［J］.Mol Cell Biol，2010，30(11):2636 －2650.

［9］Kamata T .Roles of Nox1 and other Nox isoforms in cancer development［J］.Cancer Sci，2009，100(8):1382 －1388.

［10］Laurent E，McCoy JW 3rd，Macina RA，et al.Nox1 is over－expressed in human colon cancers and correlates with activating mutations in K － Ras［J］.Int J Cancer，2008，123(1):100－107.

［11］Puca R，Nardinocchi L，Starace G，et al.Nox1 is involved in p53 deacetylation and suppression of its transcriptional activity and apoptosis［J］.Free Radic Biol Med，2010，48(10):1338 －1346.

［12］Gianni D，Taulet N，Zhang H，et al.novel and specific NADPH oxidase－1(Nox1)small－molecule inhibitor blocks the formation of functional invadopodia in human colon cancer cells［J］.ACS Chem Biol，2010，5(10):981－993.

［13］Ushio－Fukai M，Nakamura Y .Reactive oxygen species and angiogenesis:NADPH oxidase as target for cancer therapy［J］.Cancer Lett，2008，266(1):37 － 52.

［14］Tominaga K，Kawahara T，Sano T，et al.Evidence for cancer－associated expression of NADPH oxidase 1(Nox1)－based oxidase system in the human stomach［J］.Free Radic Biol Med，2007，43(12):1627 －1638.