利用酵母双杂交筛选与PtCDD相互作用的生物大分子

房 玮，周利明，赵树堂，卢孟柱*

（1. 中国林业科学研究院 重点开放实验室，北京 100091；2. 河北联合大学，河北 唐山 063000）

程序性细胞死亡（Programmed celldeath，PCD）也称细胞凋亡（Apoptosis），是细胞在一定的生理或病理条件下，为了维持内环境稳定，更好地适应生存环境而采取的一种由基因控制的细胞主动的、有序的死亡。植物和动物在抗菌反应过程中，经常伴随着PCD的产生[1]。大量研究表明，PCD对维持生物体正常生长、发育等具有举足轻重的作用。而线粒体所释放的细胞色素c在PCD过程中起重要作用，在热激诱导下的黄瓜子叶细胞编程性死亡[2]及D-甘露糖诱导的植物细胞编程性死亡[3]过程中都检测到完整的线粒体中释放出细胞色素c，Zhao等[4]采用胡萝卜细胞来源的非细胞体系，在其中加入细胞色素c作为诱导剂，结果表明细胞色素c可以高效的诱导外源细胞核发生凋亡。在维生素K3诱导的原生质体凋亡过程中，细胞色素c由线粒体释放到胞浆[5]。细胞色素c的释放可能是动、植物细胞PCD过程中共同具有的保守事件。

DNase在PCD中起关键作用。植物细胞PCD的一个重要阶段是DNA的降解（DNA片段化），DNA的片段化被认为是细胞死亡的转折点，具有不可逆性，其过程就是由DNase执行的。在植物中，研究者们分别在胚的发育、花的发育、超敏反应、环境胁迫诱导的PCD、叶片衰老、糊粉层细胞的PCD和导管分子的分化等PCD研究中均观察到了DNA的降解，同时也讨论了相关核酸酶活性的情况[6～7]。

与 PCD相关的 DNase依据其活性的离子依赖型大致可分为以下两大类[8]：Zn2＋依赖型核酸内切酶和 Ca2+依赖型核酸内切酶，其中Ca2+依赖型核酸内切酶在植物PCD的研究中报道文献较少，王雅清等在杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）分化中的次生木质部细胞中检测到了Ca2+激活的DNase活性[9]。本实验室在毛白杨（Populus tomentosa）未成熟次生木质部中同时检测到DNA的片段化和DNase活性。这个DNase大小约为38KD，体外试验表明它可以降解单链和双链DNA，其核酸酶活性依赖于Ca2+，并可被Mg2+、Zn2+所抑制。经纯化后通过质谱分析鉴定，从杨树EST库中获得了相应的基因序列，克隆了其编码基因，将此蛋白定名为PtCDD，采用原核表达、DNA－SDS-PAGE胶内分析等方法发现其编码基因具有核酸酶活性，对该基因功能的研究将有助于我们对木质部细胞程序性死亡机理的深入理解[10]。因此，为进一步认识PtCDD的编码基因——Ca2+依赖型DNase在杨树形成层发育过程中的作用机制，本研究应用酵母双杂交技术对与 PtCDD 蛋白相互作用的生物大分子进行筛选，并对结果进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

提取RNA所用植物材料为毛白杨（Populus tomentosa）剥皮后从树皮内表面所刮取的形成层和韧皮部区域，酵母双杂交系统MatchMaker购自Clontech公司，Qiagen植物总RNA提取试剂盒（RNeasy Plant Mini Kit）购自大连宝生物工程有限公司，Marke、溶菌酶、DH5α购自北京天根生化科技有限公司，载体 pGEM-T Easy、T4连接酶、限制性内切酶购自Promega公司，IPTG、卡那霉素kmycin（Kna）、氨苄青霉素ampicillin（Amp）为Sigma公司产品，质粒提取试剂盒、PCR产物凝胶回收试剂盒购自北京赛百胜生物技术公司，其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 cDNA文库的建立及诱饵蛋白表达载体的构建

参照Qiagen试剂盒说明书提取杨树形成层RNA，用MatchmakerTM Library Construction&Screening Kits构建杨树剥皮再生系统的pGADT7-cDNA文库。

扩增PtCDD全长。PCR反应条件为：95℃预变性5 min；94℃变性45 s，58℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 10 s，循环35次，最后72℃延伸8 min。PCR产物回收后通过T4连接酶连入PGEM-T easy载体，后用EcoRI 和SalI双酶切克隆载体和pGBKT7回收目的片段，构建重组质粒pGBKT7-CDD转化大肠杆菌DH5α，挑单菌落培养提质粒，用限制性内切酶方法鉴定筛选阳性重组子，送北京奥科公司测序[11]。

1.3 诱饵蛋白的自激活性及毒性测试

[12－13]的方法，以酵母菌 Y187和 AH109为受体菌，采用 LiAc转化法分别转化阴性对照质粒pGBKT7-Lam、阳性对照质粒pGBKT7-53、诱饵蛋白重组质粒pGBKT7-PtCDD及空质粒pGBKT7。将转化的菌体分别涂布相应SD/-His/Trp或SD/-Ade/-Trp平板，生长2 ～ 3 d。

将转化重组质粒和转化空载体pGBKT7的AH109和Y187酵母细胞分别在SD/-Trp/Kan（50μg/mL）液体培养基中培养16 ～ 24 h，同时测定培养液的OD600值。

1.4 α-半乳糖苷酶活性检测（显色反应）

在100 mm平皿底部加入2 mL含X-α-gal的Z buffer，加一张无菌的定性滤纸。在另一张灭菌的滤纸上做标记，用镊子夹住滤纸，让滤纸一侧先接触DDO琼脂平板上出现的AH109 酵母菌，并缓慢放到平板上，确保滤纸接触平板上所有克隆，约1 min。用镊子从一侧揭起滤纸后夹住滤纸，克隆面向上在液氮中放10 s后取出融化，重复该步骤2 ～ 3次。将融化的滤纸克隆面向上放在被含X-gal的Z buffer浸湿了的滤纸上30℃培养3 h，观察滤纸颜色变化。

1.5 酵母双杂交及结果重新验证

按照Clontech公司Protocol说明，用PEG/LiAc方法将pGBKT7-CDD质粒转化AH109，将构建的杨树剥皮再生系统的pGADT7-cDNA质粒转化Y187酵母菌，转化后的菌液涂布于SD/-His/-Trp/-Leu和SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu琼脂平板，30℃培养直至菌落出现，通常为3 ～ 8 d。挑取X-α-gal活性检测过程中变蓝的克隆，SD/-His/-Trp/-Leu液体培养基摇菌扩增，按酵母质粒提取试剂盒说明提取混合质粒，转化DH5α，涂布Amp抗性的LB培养基。利用抗性筛选出pGADT7-cDNA质粒，再用GAL4AD LD-Insert筛选引物Y2H5’和Y2H3’进行酵母菌落PCR，结果送北京奥科公司测序。登录www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST进行同源性分析。

将筛选得到的两个片段AD1-10、AD12-2重新与载体PGADT7连接，得到重组质粒后分别与pGBKT7-CDD共同转入酵母菌株AH109，用共转化的方法对两个片段所产蛋白与PtCDD的相互作用进行验证。

1.6 凝胶阻滞试验

合成AD1-10片段，采用Pierce公司的DNA 3′End-Labeling System（生物素-11-UTP）进行标记后，将其与BSA、PtCDD蛋白在体外进行结合反应，反应体系为：5×binding buffer 4μL；0.45μg/μL BSA、PtCDD纯化蛋白9μL；1M DTT 1μL；AD1-10探针1μL；H2O 4μL；冰上结合30 min，加3μL上样缓冲液（含0.025%溴酚蓝的无菌水），进行聚丙烯酰胺电泳分析。电泳1 h（200V）；用滤纸粘下胶，保鲜膜封好后，压X光片1 ～ 2 h；洗片，显影2 min，定影5 min[14]。

1.7 荧光实时定量RT-PCR

根据Primer Express 3.0分别设计PtCDD编码基因，AD1-10、AD12-2实时定量PCR所需引物。反应体系参照TaKaRa SYBR PremixEx taqTM说明书配制。

2 实验结果

2.1 诱饵蛋白表达载体的构建及序列测定

提取杨树次生维管再生系统中形成层的总RNA，反转录扩增得到双链cDNA（如图1-A）。对PtCDD进行PCR扩增，得到编码PtCDD基因的全长片段。连入pGEMT-easy克隆载体，用EcoR I和Sal I 双酶切克隆载体和诱饵质粒pGBKT7回收目的片段，构建重组质粒pGBKT7-PtCDD测序验证了所构建载体的阅读框架正确性，后将重组质粒转入AH109酵母菌株中，测序验证所构建的载体阅读框架正确性（如图1-B、图1-C）。

图1 诱饵蛋白基因PtCDD的PCR扩增及DNA-BD融合载体的构建Figure 1 polymerase chain reaction amplification of PtCDD and construction of DNA-BD fusion vector

2.2 诱饵蛋白的自激活活性鉴定和毒性检测

诱饵的蛋白本身不能具有转录激活活性，否则不能判断是由于蛋白相互作用引起的报告基因的表达，还是由于诱饵蛋白自激活活性引起的报告基因的表达，所以在进行文库筛选之前，首先进行了诱饵蛋白自激活活性鉴定。结果表明，含有pGBKT7-53、pGBKT7-Lam、pGBKT7-PtCDD及空质粒pGBKT7的转化子在SD/-His/Trp或SD/-Ade/-Trp平板上不能生长。这一结果表明pGBKT7-PtCDD诱饵蛋白没有自激活活性，可以用于文库筛选。

将转化诱饵载体pGBKT7-PtCDD和转化空载体pGBKT7的酵母细胞分别在SD/-Trp/Kan（20μg/mL）液体培养基中过夜培养16 ～ 24 h，通过测定培养液的OD600发现，二者OD600比较接近且都大于0.8。这说明诱饵蛋白对酵母细胞均没有毒性，可以直接用于酵母共转化实验。

2.3 酵母双杂交cDNA文库的构建

用RNeasy Plant Mini Kit提取杨树次生维管再生系统中形成层总RNA，用oligo（dT）作引物进行反转录反应和LD-PCR扩增得到双链cDNA。将所得cDNA与载体PGADT7-Rec连接，得到杨树形成层cDNA文库，转入Y187酵母菌株。经公式计算，3μg pGADT7-lam的酵母细胞的转化率为2.3×106，高于试剂盒所要求的1.0×106。另将对照的SV40 T PCR大片段与载体PGADT7-Rec连接作为对照。由对照的生长情况可知转入杨树形成层cDNA文库的Y187酵母菌株生长情况符合要求。

2.4 酵母双杂交筛选与PtCDD相互作用的片段

用 BD MatchmakerTMLibrary Construction & Screening Kits构建盐诱导杨树形成层 cDNA文库，以pGBKT7-PtCDD质粒为诱饵蛋白，采用酵母共转化方法筛选杨树形成层 cDNA文库。转化后的酵母菌涂布SD/-His/-Trp/-Leu/-Ade四缺培养基平板，于30℃培养箱中培养3 ～ 8 d，将长出的酵母克隆转接新的四缺平板上。结果发现2 ～ 3 d长出的较大菌落，进行显色反应。在显色反应之后真正的阳性克隆能激活报告基因MeL1，编码α-半乳糖苷酶，分解底物X-α-Gal产生蓝色，而不能生长或不能呈现蓝色的克隆可能为假阳性克隆。经显色反应可以很快变蓝的菌落可初步判断为阳性克隆，经过初筛，共得到了64个阳性克隆。

用GAL4AD LD-Insert筛选引物Y2H5’和Y2H3’进行酵母菌落PCR，对得到的64个阳性克隆进行二次筛选，发现插入的片段大小从300 ～ 400 bp不等，并且有的阳性克隆包含有多条带。根据PCR筛选结果，从中挑取带形清晰、亮度高、片段较大的38个酵母阳性克隆，提取质粒，然后转化到大肠杆菌DH5α中，涂布Amp+平板，从每个平板上挑取若干克隆，进行菌液PCR筛选并送出测序（图3）。

图2 cDNA文库转入Y187酵母菌株的生长情况Figure 2 Tthe growth of the yeast strain Y187 after cDNA library was transformated

图3 PCR对阳性克隆文库进行二次筛选示意图Figure 3 The diagram of screening Positive clones by PCR

根据测序结果，登录www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST进行同源性分析，得到了有较高研究价值的2个克隆，AD1-10和AD12-2分别为银桦线粒体的核糖体RNA小亚基基因（mtSSU）（GenBank：AF193995）和杨树叶片在干旱胁迫条件下得到的一种EST（GenBank：CU23122）。

将筛选得到的阳性克隆质粒分别与诱饵载体pGBKT7-PtCDD共转化酵母AH109，在SD/-His/-Trp/-Leu/-Ade平板上观察菌斑生长情况。另外用这2个质粒分别与阴性对照质粒pGBKT7-Lam共转化酵母菌AH109作为对照，在SD/-Leu/-His/-Trp/-Ade培养基上进行鉴定（图4）。

图4 重新验证及假阳性克隆的排除Figure 4 Re-verification and elimination of flase Positive clones

图5 片段AD1-10与PtCDD蛋白的体外结合Figure 5 Combination of AD1-10 and PtCDD protein

2.5 凝胶阻滞验证PtCDD蛋白与AD1-10的结合

PtCDD属于Ca2+依赖型DNase，具有与DNA结合的特性，在前面的实验中，已证明PtCDD在酵母细胞内能结合MtSSU片段AD1-10的功能。为此，合成了AD1-10片段，用（生物素-11-UTP）标记作为探针。将其与BSA、PtCDD蛋白在体外进行结合反应，非变性PAGE胶电泳ZH转膜后进行生物素的检测。放射自显影结果表明，PtCDD与AD1-10探针具有结合功能，电泳条带被阻滞，BSA不具有AD1-10探针的结合功能，因此电泳条带没有被阻滞（图5）。通过Light shift EMSA实验，体外验证了PtCDD蛋白与mtSSU片段AD1-10的结合。

3 讨论

木材的形成过程包括形成层木质部侧的母细胞分裂、细胞的延伸扩展（衍生细胞不断伸长直至其最终大小的伸长区）、次生细胞壁的沉积、木质化和伴随木质化和细胞壁次生加厚的细胞程序性死亡（PCD）。DNase在PCD中起关键作用[15,16]，目前，植物PCD过程当中DNase与线粒体的具体作用机制还不是十分清楚，本实验以pGBKT7-PtCDD为诱饵质粒在杨树形成层cDNA文库中进行筛选，得到的AD1-10、AD12-2片段。经GenBank分析后发现，编码AD1-10的基因为银桦线粒体的核糖体RNA小亚基基因（mtSSU）（GenBank：AF193995），编码AD12-2为杨树叶片在干旱胁迫条件下得到的一种EST，功能未知（GenBank：CU231222）。

本实验中所筛选到得AD1-10为mtSSU基因片段，mtSSU线粒体的核糖体RNA小亚基基因，所以本研究又进行了凝胶阻滞实验，体外验证了PtCDD蛋白与mtSSU片段AD1-10的结合。由实验结果可知PtCDD可能在杨树体内与线粒体的核糖体基因结合。

线粒体在植物细胞程序化死亡过程中起着非常重要的作用。植物细胞中存在线粒体通透性转变孔道（PT pore），植物细胞究竟是存活、程序性死亡还是坏死都受控于线粒体通道的开放程度。线粒体内部凋亡性因子的释放、膜电位的改变、氧活性的产生、电子传递链的破坏、ATP合成量的减少都参与并且可能影响细胞死亡的不同形式，因此可以认为线粒体是细胞存活或者死亡的中心调节因子[1]。而 PtCDD是一种 Ca2+依赖性的DNase，具有DNA的结合活性，在Ca2+完全可能直接与DNA结合。由此PtCDD直接在杨树体内与线粒体的基因结合的话，便可能影响整个PCD的过程，而具体的作用机制有待于进一步研究。

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