汉防己甲素对低温灌洗保存大鼠供肝的肝功能影响的实验研究

陈保华，黄 荣，姚 斌，毛 英(解放军第184医院外二科，鹰潭 335000)

脏器的保存是移植外科的3大支柱之一，获取新鲜和高质量的供肝是保证肝移植成功的先决条件。自18世纪至今，广大学者一直在研究既经济又实用的对供肝灌洗保存具有良好保护作用的药物。目前汉防己甲素(TET)对肝脏的保护作用日益受到重视，但尚未见TET在低温灌洗保存下对肝脏作用的研究报道，本实验选择SD大鼠，以4℃的TET溶液直接灌洗等方式保存供肝，以观察TET在大鼠供肝低温灌洗保存中对肝细胞钙超载及肝功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

采用成年健康SD大鼠80只，雌雄不拘，体重(250±10)g，由中科院实验动物中心提供，等级SPF，合格证号:0034376，许可证号:SCXK(沪)2009—0006。以完全随机设计方法分成4组，A组(对照组)不注射药物，以4℃乳酸林格液进行供肝灌洗后再以该液保存。B组(TET注射组)术前24及2 h腹腔内注射TET(10 mg·kg－1，杭州康恩贝药厂出品)，以4℃乳酸林格液进行供肝灌洗后再以该液保存。C组(TET灌洗组)术前24及2 h腹腔内注射TET(10 mg·kg－1)，以4℃乳酸林格液中加入TET(30 mg·L－1)进行供肝灌洗后再以该液保存。D组(Collins组)不注射药物，以4℃ Collins液进行供肝灌洗后再以该液保存。各组供肝低温保存时间均为4 h。

1.2 实验方法

实验前12 h动物禁食，自由进水。乙醚麻醉后取仰卧位，腹部弧型切口，顺时针分离肝下腔静脉、右肾静脉、右三角韧带及镰状韧带，结扎左膈静脉，行胆总管插管引流，肝动脉结扎离断，游离出门静脉远端并予结扎，然后经门静脉插管并持续滴注法行供肝原位底压重力灌洗。同时剪开肝下腔静脉，边灌注边放血，至肝颜色变淡呈均匀土黄色，即取下肝脏置于保存液中保存。

1.3 标本收集及测试方法

1.3.1 肝功能检测:分别取各组的保存液2 mL，检测肝功能。取保存液前，用注射器抽取5 mL保存液，缓慢冲洗肝脏，然后将保存液摇均，取样检测。各组取样本20 μL，分别加入丙氨酸转氨酶(ALT)试剂300 μL和乳酸脱氢酶(LDH)试剂300 μL(上海长征试剂公司产品)，测定波长为340 nm，应用日本7150型全自动生化分析仪检测。

1.3.2 肝细胞内游离钙浓度的检测:(1)肝细胞悬液制备:取肝组织约2 g置于4℃1640培养液中，冰浴下剪切成约1 mm×1 mm×1 mm大小，动作须轻柔，用200目尼龙网过滤，低温离心(4 000 r·min－1)15 min。去上清液后加1640培养液1 mL混匀成悬液备用。(2)试剂:Fura-2/AM粉剂及DMEM均购自Sigma公司;小牛血清购自上海生化所，其他试剂均为分析纯。(3)仪器:AR-CM-MIC阳离子测定仪(美国SPEX公司生产)，离心机、恒温孵箱、倒置显微镜(Olymphas公司生产)。(4)肝细胞悬液处理:吸取0.1 mL制备好的肝细胞悬液，然后加上小牛血清、无钙Krebs缓冲液及Fura-2/AM，于30℃温孵35～40 min，负载后，用无钙Krebs缓冲液洗脱 2 次，分别以 4 000 r·min－1离心 15 min，弃上清液，加入无钙缓冲液后即制成肝细胞悬液。然后取悬液置于载玻片上，通过样品选择窗口来选择样品中的单细胞测定，激发光波长分别为340、380 nm，发射光波长为505 nm，采样间隙为1.0 s，连续记录细胞的荧光强度得出F340 nm/F380 nm的比值。使用DM 3000软件，肝细胞内游离钙浓度按下式计算:([Ca2+]i):[Ca2+]i=Kd×(Fo/Fs)×(R －Rmin)/(Rmax－R)。

1.4 病理学及超微结构观察

(1)光镜观察:取肝脏组织1 cm ×1 cm ×1 cm，100 g·L－1甲醛固定，石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜下观察摄片。(2)电镜下观察:取肝组织约 1 mm ×1 mm ×1 mm，20 g·L－1戊二醛固定，用枸缘酸铅溶液染色，在PHILIPS EM-400透射电镜下观察摄片。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各组中ALT、LDH含量及肝细胞内钙浓度比较

B、C 2组与A组比较，前2组中ALT、LDH含量及Ca2+浓度显著较A组低，具有统计学意义(P＜0.05)，提示TET具有减轻低温灌洗保存下肝细胞的钙超载并保护肝功能的作用;B、C 2组比较，C组ALT、LDH含量及Ca2+浓度显著较A组低，具有统计学意义(P＜0.05)，提示用TET溶液直接灌洗保存供肝比TET腹腔注射保存供肝在减轻低温灌洗保存下肝细胞的钙超载和保护肝功能方面效果更好。C、D 2组各指标间差异无统计学意义(P＞0.05)，提示用TET溶液灌洗并保存供肝4 h与Collins液灌洗保存组效果相近。各组中ALT、LDH含量及肝细胞内钙浓度测定结果见表1。

表1 各组中ALT、LDH含量及肝细胞内钙浓度测定结果Tab 1 ALT and LDH contents and Ca2+density within liver cells of each group

2.2 超微结构观察结果

各组肝组织在光镜下观察可见:C、D 2组可见中央静脉周围肝细胞轻度肿胀外，其余未见明显异常;B组可见中央静脉周围肝细胞肿胀，汇管区淋巴细胞浸润，肝细胞浊肿、颗粒变性;A组除上述所见加重外，还可见肝细胞间连接松解、出现裂隙，肝小叶灶性肝细胞退变、坏死。各组肝组织在电镜下观察可见:各组肝细胞的线粒体肿胀、嵴排列紊乱、模糊、基质淡、内质网扩张等变化，A组最为严重，B组次之，C、D 2组明显减轻。

3 讨论

TET为中药提取物，又称粉防己碱，是我国研制的一种钙通道阻滞剂，作用类似维拉帕米[1-3]，其药理作用非常广泛，除有利水消肿、抗菌消炎、抗肿瘤的作用外，研究表明[4]TET能显著改善肝功能，减轻肝脏病理损伤程度，抑制肝脏细胞外间质合成;并可减少自由基的产生和纠正SOD等的生成不足[4]。虽然目前尚未见TET对低温灌洗保存肝脏的作用研究的报道，但据上述理论推断TET对低温灌洗保存供肝可能有积极的作用。

本实验选择SD大鼠，以4℃的TET溶液直接灌洗等不同的给药方式灌洗并保存供肝，分别测定肝细胞内钙值及检测肝功能和进行组织学检查，并与Collins液灌洗保存组相比较，以观察TET在低温灌洗保存中对大鼠供肝的保护作用。肝功能检测和肝脏病理学检查结果表明，使用TET后，与肝功能有关的酶学指标与未用者比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，病理损害也较之明显减轻，尤其在C组，这种差异更为明显，说明TET对低温灌洗保存下的肝脏有保护作用，可保护肝细胞膜性结构，防止肝细胞肿胀和变性，保护肝功能。实验也表明，用TET溶液直接灌洗保存供肝比TET腹腔注射给药保存供肝，在减轻低温灌洗保存下肝细胞的钙超载和保护肝功能方面效果更好，可能是因为通过门静脉系统灌注TET，可使其更广泛均匀地分布于肝脏中，药理作用得以充分发挥，在肝脏保存的冷缺血期，这种保护作用对减轻保存损伤尤显重要。

TET能显著性地减轻低温灌洗保存下肝细胞的钙超载从而对肝功能具有保护作用，直接灌洗保存供肝比TET腹腔注射给药效果好，TET对供肝的灌洗保存有积极的作用，因此推断该药有望用于临床供肝的保存。

[1]刘东举，崔 宏，崔桂英，等．钙通道阻滞剂对低温保存大鼠肝脏的保护作用[J]．中华器官移植杂志，2001，22(2):94.

[2]张 浩，王学浩，张 峰．钙离子阻滞剂在肝脏灌洗保存的保护作用[J]．中华器官移植杂志，2000，21(1):58.

[3]Haddad P，Cabrillac JC，Piche D，et al．Changes in intracellular calcium induced by acute hypothermia in parenchymal，endothelial，and Kupffer cells of the rat liver[J]．Cryobiology，1999，39(1):69.

[4]韩聚强，胡 聪，刘树贤，等．复方中药体外保护肝细胞的机制[J]．世界华人消化杂志，2001，9(8):902.