消癌平片微生物限度检查法验证

陆娟，陈建玲

(湖北省襄阳市食品药品检验所，441021)

消癌平片是一种抗癌、消炎、平喘药，主要成分是乌骨藤，临床多用于食道癌、胃癌、肺癌等多种恶性肿瘤。本品具有一定的抑菌作用，用常规方法对其进行微生物限度检查时，结果不能真实反映样品的污染情况。按《中华人民共和国药典》2010年版规定，在进行微生物限度检查时，应对所用方法进行验证，以确认所采用的方法适合该产品，准确有效地检出样品中污染的微生物［1］。按照《中国药品检验标准操作规范》［2］及参考有关文献［3-6］，笔者采用培养基稀释法进行验证，报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 立式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)，HTY-761型匀浆仪(杭州泰林生物技术设备有限公司)，202-2型电热恒温干燥箱(上海浦东跃欣科学仪器厂)，SPX-150生化培养箱(慧科电子有限公司)，生物安全柜(苏净安泰)。

1.2 菌种 大肠埃希菌［CMCC(B)44102］，金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］，枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］，白念珠菌［CMCC(F)98001］，黑曲霉［CMCC(F)98003］。

1.3 培养基及稀释剂 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基(BL)、胆盐乳糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基，以上均由北京三药科技开发公司提供。含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，0.9%灭菌氯化钠溶液，pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，新配。

1.4 供试品 消癌平片(湖北创力药业有限公司，批号:20101101，20101201，20110101)。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备

2.1.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液 取营养琼脂斜面新鲜培养物，接种于营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24 h;用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每毫升含菌数为50～100 cfu的菌悬液。

2.1.2 白念珠菌菌液 取新鲜培养物接种于改良马丁培养基23～28℃培养24～48 h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每毫升含菌数为50～100 cfu的菌悬液。

2.1.3 黑曲菌液 取新鲜培养物，接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7d，用含0.05%聚山梨酯80的无菌0.9%氯化钠溶液8mL将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%聚山梨酯80的无菌0.9%氯化钠溶液稀释制成每毫升含孢子50～100 cfu的孢子悬液。

2.2 供试液制备 取供试品10 g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100mL，用匀浆仪以2 000 r·min-1的转速旋转30 s，制备成1∶10的供试液。

2.3 回收率测定

2.3.1 实验组 常规法:取供试液和实验菌液各1mL，分别注入平皿，立即倾入相应培养基，摇匀待凝固后按规定条件培养，每日观察计算菌落数，每种实验菌平行制备2个平皿，结果见表1。

培养基稀释法:取供试液0.2mL和实验菌液1mL分别注入平皿，立即倾入相应培养基，摇匀待凝固后按规定条件培养，每日观察计算菌落数，每种实验菌平行制备10个平皿，结果见表2。

2.3.2 菌液组 取上述实验菌液按常规法测定每一种菌株所加的实验菌数。

2.3.3 供试品对照组 常规法:取供试液1mL注入平皿，立即倾入相应培养基，摇匀待凝固后按规定条件培养，每日观察计算菌落数，每种实验菌平行制备2个平皿，结果见表1。培养基稀释法:取供试液0.2mL注入平皿，立即倾入相应培养基，摇匀待凝固后按规定条件培养，每日观察计算菌落数，每种实验菌平行制备10个平皿，结果见表2。

2.3.4 稀释剂对照组 用相应稀释剂代替供试液加入实验菌，使菌液最终浓度为50～100 cfu·mL－1按实验组方法进行菌落计数。

2.3.5 结果判断 回收率(%)=(实验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%。

2.4 控制菌检验验证

2.4.1 实验组 取1∶10供试液10mL接种至100mL胆盐乳糖培养基中，同时加入50～100 cfu·mL-1大肠埃希菌菌液1mL，35℃培养24 h，取培养物0.2mL，接种至含MUG培养基5mL的试管中，35℃培养，5，24 h在366 nm紫外光灯下观察，管内培养物呈现蓝白荧光，为MUG阳性;然后进行靛基质实验，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性。

2.4.2 阴性菌对照组 方法同实验组，实验菌为金黄色葡萄球菌菌液。结果管内培养物不呈现荧光，为MUG阴性;然后进行靛基质实验，液面呈试剂本色，为靛基质阴性。

表1 常规法回收率测定结果

表2 培养基稀释法回收率测定结果

2.4.3 供试品对照组 方法同实验组，但不加实验菌，结果同阴性菌对照组。

2.4.4 结果判断 实验组检出实验菌，阴性菌对照组未检出实验菌，结果符合要求，控制菌按常规法检查即可。

3 讨论

消癌平片的微生物限度检查验证实验中，稀释剂对照组各菌落计数回收率均＞70%;常规法菌落计数大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率＜70%;培养基稀释法各菌落计数回收率均＞70%，按供试品制备方法和培养基稀释法对消癌平片进行细菌检查，真菌和酵母菌检查、控制菌检查采用常规法是固定可行的。

实验制备计数用的菌液稀释到合适的浓度后，菌落数在48 h后有较大变化，宜控制好实验时间，实验的同时进行活菌计数，才能保证实验结果的准确性。

目前国家越来越重视微生物限度检查，《中华人民共和国药典》收载的品种也越来越多。《中华人民共和国药典》从2005年版开始对微生物限度检查要求进行方法学的验证实验。由于某些供试品具有抗菌或抑菌活性，其本身会影响检验结果的准确性。通过方法学验证，避免了采用常规方法难以检出菌落，而得出“阴性”或计数偏低的“合格”结论的情况。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录C 79－88.

［2］中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:351－407.

［3］颜栋林，李萍，兰茜.冠心丹参片微生物限度检查法方法验证［J］.医药导报，2010，29(8):1080－1081.

［4］张丽梅，李俊，邢建华.抗生丸微生物限度检查法的验证［J］.医药导报，2009，28(6):792－793.

［5］李俊，张丽梅.6种中成药微生物限度检查方法验证［J］.医药导报，2010，29(9):1222－1223.

［6］马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册［M］.北京:科学出版社，2000:65.