褪黑素对大鼠急性酒精性肝损伤的作用

2011-07-28洪汝涛陈世林阮海玲许建明

中国药理学通报 2011年11期

洪汝涛，陈世林，阮海玲，梅俏，许建明

(安徽医科大学第一附属医院消化内科，安徽省消化病重点实验室，安徽合肥 230022)

褪黑素(melatonin，MT)是松果体分泌的激素之一，体内许多组织器官和肿瘤组织［1］都有MT受体分布，MT以受体依赖或非依赖的方式发挥广泛的生物学作用。近年来发现褪黑素是一种高效的自由基清除剂，其对急慢性肝损伤的保护作用国内外已有研究和报道［2－5］。但MT对急性酒精性肝病的防治未见报道。本研究以急性酒精性肝损伤大鼠为模型，观察MT对急性酒精性肝损伤的作用，并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物清洁级SD♂大鼠24只，购自安徽省实验动物中心，体质量(200±20)g，标准环境适应性饲养1周，给予正常饮食。

1.2 主要药物、试剂褪黑素系美国Sigma公司产品，临用前以无水乙醇溶解，再加生理盐水稀释至所需浓度(无水乙醇含量≤1%)。乙醇(分析纯)购自上海中试化工总公司，使用前用蒸馏水配成60%的体积分数。MDA、SOD检测试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。兔抗鼠TNF-α多克隆抗体、羊抗兔IgG二抗试剂盒、DAB显色剂均购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗鼠IL-1β多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，内源性生物素阻断试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。

1.3 动物分组及处理 24只♂ SD大鼠随机分为3组:正常对照组、模型、对照组、褪黑素组，每组8只。各组每日灌胃前禁食6 h，除正常组等量生理盐水灌胃外，其余两组均乙醇灌胃5 g·kg－1，每日1次，连续5 d。褪黑素组在乙醇灌胃1 h后再给予褪黑素50 mg·kg－1灌胃，在末次乙醇灌胃并禁食6 h后将全部大鼠以3%戊巴比妥钠(1 ml·kg－1)麻醉并处死，腹主动脉取血，并取出肝脏。血标本离心后取上清，－20℃冷冻以备生化检测。取新鲜肝右叶1 g，加入9倍体积生理盐水，于冰浴中制成10%(1∶9，W/V)肝匀浆，4℃ 1 420×g离心15 min，取上清－20℃冷冻以备检测SOD活性、MDA含量。在左肝叶同一部位，取一小块肝组织，用10%中性甲醛固定以备病理及免疫组化检查。

1.4 大鼠血清转氨酶活性测定采用瑞士Roche Modular DPP全自动生化分析仪测定大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性。

1.5 肝匀浆MDA含量和SOD活性测定采用生化方法，按试剂盒说明书进行。

1.6 病理学检查 10%中性甲醛固定肝组织，石蜡包埋并切片，常规HE染色，光镜下观察。

1.7 免疫组化法检测肝组织中TNF-α和IL-1β表达采用S-ABC法。切片常规脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液微波炉中抗原修复，加入一抗(分别为1∶100、1∶300)4℃过夜，加二抗室温下孵育，加试剂SABC，DAB显色，苏木精复染、脱水、透明、封片。每批实验均设阴性对照，以PBS液代替一抗。其结果判断方法为:以细胞内有明显黄色/棕黄色颗粒判定为阳性细胞。平均光密度(OD)测量:在Nikon E-clipse 8ic显微镜下，每张切片随机选取5个不连续视野(×200)，用Nikon Digital camera摄像并保存待测量图片，Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测OD值，取每张切片平均OD值作为每张切片测量值。

1.8 统计学处理采用SPSS 11.5统计软件包处理，计量资料采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析(LSD法)。

2 结果

2.1 褪黑素对急性酒精性肝损伤大鼠血清ALT、AST活性的影响与正常对照组比较，模型对照组血清中ALT、AST活性明显升高。与模型对照组比较，褪黑素组血清ALT、AST活性明显降低(Tab 1)。

Tab 1 Effect of melatonin on serum ALT，AST activities in rats with liver injury induced by acute ethanol administration(±s，n=8)

▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs normal group;★P ＜0.05，★★P ＜0.01 vs model group.

Group ALT/U·L－1 AST/U·L －1 Normal 63.12 ±13.40 146.12 ±27.34 Model 81.00 ±15.84▲ 196.37 ±31.33▲▲Melatonin 65.25 ±14.87★ 148.00 ±24.50★★

2.2 褪黑素对急性酒精性肝损伤大鼠肝匀浆MDA含量、SOD活性的影响与正常对照组比较，模型对照组肝匀浆中MDA含量明显升高，SOD活性明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05)。与模型对照组比较，褪黑素组肝组织匀浆中MDA含量明显降低，SOD活性明显升高(均为 P＜0.05)(Tab 2)。

2.3 褪黑素对急性酒精性肝损伤大鼠肝脏病理组织学变化的影响光镜下可见正常对照组大鼠肝脏无明显病理改变，仅肝小叶内偶见脂肪变性的肝细胞，模型对照组肝细胞肿胀明显，可见较明显脂肪变性，胞质内出现弥漫性的圆形脂滴，肝小叶界限模糊，其内散见肝细胞点状坏死。与模型对照组比较，褪黑素组肝细胞肿胀、脂肪变性有所减轻(Fig 1)。

2.4 褪黑素对急性酒精性肝损伤大鼠肝组织中TNF-α和IL-1β表达的影响与正常对照组比较，模型对照组中央静脉周围及部分肝小叶内可见较多黄色/棕黄色颗粒沉着，TNF-α和IL-1β OD值较正常对照组明显升高。与模型对照组比较，褪黑素组中央静脉周围及肝小叶内黄色/棕黄色颗粒明显减少，TNF-α和IL-1β OD值较模型对照组明显降低(Tab 3，Fig 2，3)。

Tab 2 Effect of melatonin on MDA content and SOD activity in liver homogenates in rats with liver injury induced by acute ethanol administration(±s，n=8)

▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01 vs normal group;★P ＜0.05 vs model group.

Group MDA/μmol·g－1Pro SOD/U·mg－1Pro Normal 2.24 ±0.70 116.58 ±18.36 Model 3.63 ±0.40▲▲ 90.61 ±23.20▲Melatonin 2.96 ±0.57★ 113.90 ±11.99★

Fig 1 Pathological changes(HE staining，×200).

Fig 2 Expression of TNF-α in liver section taken from rats(SABC ×200).

Fig 3 Expression of IL-1β in liver section taken from rats(SABC×200).

Tab 3 Effect of melatonin on expression of TNF-α and IL-1β in rat liver in rats with liver injury induced by acute ethanol administration(OD，±s，n=8)

▲▲P ＜0.01 vs normal group;★P ＜0.05，★★P ＜0.01 vs model group.

Group TNF-α IL-1β Normal 0.193 ±0.032 0.147 ±0.014 Model 0.263 ±0.018▲▲ 0.228 ±0.019▲▲Melatonin 0.235 ±0.011★ 0.187 ±0.020★★

3 讨论

MT对慢性酒精性肝病的防治作用仅见个别报道，对急性酒精性肝病的防治未见报道。本实验中，MT能明显降低急性酒精性肝损伤大鼠血清ALT、AST活性，减轻急性酒精性肝损伤大鼠肝组织病理改变，说明MT对大鼠急性酒精性肝损伤具有改善作用。同时，实验显示，MT能明显降低大鼠肝组织中脂质过氧化产物 MDA的含量，升高抗氧化酶SOD的活性，说明MT不仅能通过直接清除自由基而抗氧化，还能通过提高肝内抗氧化酶活性而抗氧化，亦即间接抗氧化作用，这与以前的研究结果一致［6－7］。

目前认为酒精对肝脏损伤的主要机制有以下几个方面［8－9］:内毒素、氧化应激、细胞因子。肝内蓄积的酒精及其氧化代谢产物可直接刺激机体产生内毒素(LPS)，血液中内毒素升高，激活肝脏Kuffer细胞产生大量核转录因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)和其它转录因子如AP-1、EGR-1，这些转录因子促进活化的肝脏Kuffer细胞转录TNF-α、IL-1，PGE2等炎症因子。其中NF-κB是酒精性肝病中促炎症因子(如TNF-α)表达的关键转录因子之一，而TNF-α是酒精性肝病发生的关键性细胞因子。TNF-α可直接引起肝细胞脂肪变性、炎症及坏死。在大鼠的试验中，抗TNF-α抗体已经显示能阻断酒精诱导的肝损伤的进展，用其治疗酒精性肝炎患者的小规模临床试验正在进行［9］。IL-1β也是酒精性肝病发病过程中的重要的炎症因子，是强致炎因子，可诱导急性时相蛋白产生，还可引起体内致热原增多、诱导IL-8(中性粒细胞的活化及趋化性的刺激因子)产生和促进中性粒细胞浸润等。已有研究发现MT可以抑制NF-κB活性从而影响某些病理过程，体外实验发现MT可抑制Hela细胞增殖，下调Hela细胞NF-κB蛋白水平，考虑其抑制Hela细胞增殖作用可能与下调NF-κB蛋白水平有关［10］;在呼吸道合胞病毒感染的巨噬细胞和溃疡性结肠炎模型中，MT通过抑制 NF-κB活性而降低炎症因子 TNF-α、ICAM-1的表达［11－12］。本实验显示模型组肝组织中TNF-α和IL-1β表达明显增强，MT能明显降低其表达，提示MT能减少酒精性肝损伤时细胞因子的生成，其机制是否为MT通过抑制Kupffer细胞NF-κB活性进而影响TNF-α和IL-1β等细胞因子表达是我们进一步研究的课题。

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