差示光度法测定高含量茶氨酸

高小红，章小林

(1.武汉理工大学华夏学院化学与制药工程系，湖北 武汉 430223；2.华烁科技股份有限公司，湖北 武汉 430074)

茶氨酸是茶叶中特有的一种氨基酸，其含量直接影响到茶叶的品质[1]。自1950年日本学者首次分离出茶氨酸以来，已经出现了多种分析方法[2]，但由于茶氨酸制品成分比较复杂，特别是含有许多与茶氨酸性质极其相似的氨基酸，导致碱式碳酸铜沉淀法和高氯酸非水滴定法具有明显的误差；普通吸光光度法和仪器分析法由于相对误差较大或者需要价格高昂的标准对照品，也不适用于日常高含量茶氨酸制品的分析。目前，国内外多采用日本药局(JP2000)标准，通过测定比旋光度和熔点来确定制品的纯度。

作者在前期工作[3]的基础上，采用差示光度法测定高含量的茶氨酸，取得了满意的结果。

1 实验

1.1 试剂与仪器

茶氨酸标准品，碳酸氢钠，盐酸，氢氧化钠，亚硝酸钠，次氯酸钠，碘化钾，可溶性淀粉，均为分析纯。

721型分光光度计，上海第三分析仪器厂。

1.2 溶液配制

碳酸氢钠溶液：称取碳酸氢钠60.0 g，溶于约500 mL蒸馏水中，定容至1000 mL。

茶氨酸标准溶液：称取105 ℃烘至恒重(约2 h)的茶氨酸标准品0.4000 g，加6.0 mol·L-1盐酸10 mL，在80 ℃加热回流5 h，然后加1.0 mol·L-1NaOH溶液60 mL，定容至1000 mL，得400 μg·mL-1茶氨酸标准溶液。取上述标准溶液5 mL稀释至100 mL，即得20 μg·mL-1茶氨酸标准溶液。

亚硝酸钠溶液：称取亚硝酸钠5.0 g，溶于约50 mL蒸馏水中，定容至100 mL。

次氯酸钠溶液：取市售次氯酸钠试剂，用碘量法标定有效氯含量(不低于5.2%)后，用去离子水稀释至有效氯含量为5 g·L-1。

显色液：称取1.0 g可溶性淀粉，用2 mL蒸馏水调匀，加入100 mL沸腾的蒸馏水，边摇边加热，煮沸2 min，冷却后以定量滤纸滤去不溶物，加入1.0 g氢氧化钠，摇至全部溶解后，加入1.0 g碘化钾。

1.3 方法

取2个50 mL容量瓶，1#瓶加入400 μg·mL-1的茶氨酸标准溶液1.00 mL、20 μg·mL-1的茶氨酸标准溶液2.00 mL和碳酸氢钠溶液20 mL，2#瓶加入400 μg·mL-1的茶氨酸标准溶液1.00 mL 和碳酸氢钠溶液20 mL，混匀；分别加入3 mL次氯酸钠溶液，放置1 min；加入亚硝酸钠溶液5 mL，混匀，放置5 min；加入2 mL显色液，用碳酸氢钠溶液定容至刻度，充分摇匀后，立即(2～10 min内)以蒸馏水为参比用3 cm比色皿在分光光度计上于570 nm波长处分别测定其吸光度值A1和A2，计算△A=A1-A2。

2 结果与讨论

2.1 吸收光谱

配制一定浓度的茶氨酸标准溶液，按1.3方法操作，用分光光度计在490～690 nm范围内测其吸光度△A，结果见图1。

图1 吸收光谱

由图1可见，最大吸收波长为570 nm。因此，后续实验选择570 nm为测定波长。

2.2 条件实验

2.2.1 次氯酸钠溶液加入量的选择

按1.3方法，固定其它试剂加入量不变，改变次氯酸钠溶液加入量为1～5 mL，测其吸光度。结果表明，次氯酸钠溶液加入量选择3 mL较为适宜。

2.2.2 亚硝酸钠溶液加入量的选择

按1.3方法，固定其它试剂加入量不变，改变亚硝酸钠溶液加入量为3～7 mL，测其吸光度。结果表明，亚硝酸钠溶液加入量选择5 mL较为适宜。

2.2.3 显色液加入量的选择

按1.3方法，固定其它试剂加入量不变，改变显色液加入量为1～3 mL，测其吸光度。结果表明，显色液加入量选择2 mL较为适宜。

2.2.4 碳酸氢钠溶液加入量的选择

按1.3方法，固定其它试剂加入量不变，改变碳酸氢钠溶液加入量为20～39 mL，测其吸光度。结果表明，碳酸氢钠溶液加入量≥28 mL时，吸光度△A保持不变。这是因为碳酸氢钠是一种缓冲溶液。为保持本实验体系pH值恒定，本实验用碳酸氢钠溶液将溶液定容至50 mL。

2.2.5 显色稳定时间的确定

胺的氯代衍生物能氧化碘化钾而析出碘，在加入淀粉后，溶液的颜色即可达到最深，10 min内吸光度稳定。因此，须在10 min内完成测定。

2.3 工作曲线及检出限

取6个50 mL容量瓶，各加入400 μg·mL-1茶氨酸标准溶液1.00 mL，再分别加入20 μg·mL-1茶氨酸标准溶液0 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL，在上述选定的实验条件下，以400 μg·(50 mL)-1(8.0 mg·L-1)茶氨酸标准溶液为参比，测定△A。结果表明，茶氨酸浓度在8.0～10.0 mg·L-1范围内，△C(△C为各容量瓶中所含茶氨酸的微克数与参比溶液的差值)与吸光度△A呈线性关系，线性回归方程为：△A=0.0061△C，R=0.9998。

2.4 干扰实验

实验测定460 μg·(50 mL)-1茶氨酸时，1 mg·(50 mL)-1的谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸均不干扰测定。

2.5 精密度实验

按1.3方法测定9.2 mg·L-1茶氨酸溶液，平行11次测定结果的相对标准偏差≤0.3%，符合分析高含量物质的精度要求。

2.6 样品分析

准确称取茶氨酸样品0.3000 g，加6.0 mol·L-1盐酸10 mL，在80 ℃加热回流5 h，然后加入1.0 mol·L-1NaOH溶液60 mL，定容至1000 mL，分取适量的样品溶液(控制茶氨酸浓度在8.0～10.0 mg·L-1范围内)，按1.3方法进行分析测定并进行加标回收实验，结果见表1。

表1 样品中茶氨酸测定结果

3 结论

以8.0 mg·L-1茶氨酸标准溶液为参比，在570 nm波长处进行差示光度测定。结果表明，茶氨酸浓度在8.0～10.0 mg·L-1范围内△C与△A呈线性关系；9.2 mg·L-1茶氨酸溶液相对标准偏差≤0.3%。该法操作简单、费用低、准确度高，结果令人满意，用于高含量茶氨酸的测定，可排除其它氨基酸的干扰。

[1] 王泽农.茶叶生物化学[M].北京：农业出版社，1980：48-56.

[2] 高小红，袁华.茶氨酸的分析测试研究[J].氨基酸和生物资源，2004，26(2)：74-76.

[3] 高小红，章小林，袁华.分光光度法测定茶叶中的茶氨酸[J].光谱实验室，2005，22(3)：524-526.