反相高效液相色谱法测定癌痛消颗粒中野黄芩苷的含量

李文仕

广西百色食品药品检验所，广西 百色 533000

近年来原发性肝癌发病率及死亡率呈上升趋势，研究抗肿瘤药物成为热点。癌痛消颗粒是治疗原发性肝癌的纯中药制剂，其处方由白花蛇舌草、半枝莲、元胡等11味中药组成。药效学研究表明癌痛消颗粒能明显降低肝癌细胞DNA含量，促使癌细胞凋亡[1-2]，明显改善患者的临床表现如肝区疼痛等，显示出了一定的抗癌疗效，有较好的市场前景。半枝莲是癌痛消颗粒中的君药成分，为唇形科黄芩属植物半枝莲（Scutellaria barbata D.Don）的干燥全草，临床多用于治疗癌症、肝炎等[3-4]。故可将半枝莲作为控制癌痛消颗粒质量的考查指标。半枝莲中化学成分主要含有生物碱、糖类及黄酮类化合物[5]，其中野黄芩苷的含量可达到1%[6-7]。因此拟定将野黄芩苷作为癌痛消的定量指标。半枝莲的含量测定方法主要有紫外分光光度法、比色法、HPLC法、毛细管电泳法等。而HPLC法是色谱法中应用最广泛的方法，利用高压泵加压，使载体流中各种溶质快速通过分离管，在短时间内完成复杂的分析工作，其分析特点是快速、准确、可靠，越来越成为很多药品含量测定的首选方法[8]。为使药物达到安全、有效、可控和稳定，实验探索研究建立癌痛消颗粒的含量测定方法，参照有关资料[6-10]采用RP-HPLC测定其含量，以保障用药安全。

1 仪器与试药

日本岛津公司LC-20A高效液相色谱仪，SPD-M10A二极管阵列检测器，岛津LC-Solution色谱工作站；METTLER GR-202电子天平；超声仪（功率 100 W，频率 50 Hz），MILLI-PORE纯水处理器。野黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110842-200605）；癌痛消颗粒（广西中医学院制药厂提供， 批号：090201、090202、090203）；石油醚 （60～90℃）、磷酸均为分析纯；甲醇为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Shimadzu Class-VP-ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸（34∶66），流速：1.0 ml/min；检测波长：335 nm；柱温：室温；理论塔板数按野黄芩苷峰计应不低于5500。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷减压干燥24 h的野黄芩苷对照品5.45 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。再精密吸取对照品储备液2.5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每毫升含野黄芩苷0.0545 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量研细，取约10 g，精密称定，置索氏提取器中，加入100 ml石油醚（60～90℃）提取至无色，弃去石油醚液，药渣挥尽石油醚，加100 ml甲醇继续提取至无色，回收甲醇，残渣加甲醇使溶解，转移至25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按制备工艺，制成缺半枝莲的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法，制得阴性对照溶液。

2.3 阴性干扰试验

分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液与供试品溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。结果表明，对照品溶液、供试品溶液色谱图中20.7 min出峰处成分为野黄芩苷，阴性对照溶液在20.7 min时无色谱峰出现，表明处方中其他组分对野黄芩苷的测定没有干扰。各色谱图见图1。

图1 对照品、供试品、阴性对照溶液HPLC色谱图

2.4 线性关系考察

分别精密吸取上述对照品储备液 1、2、3、4、5、6 ml，置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配成不同浓度的对照品溶液，再分别吸取各溶液10 μl，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定峰面积。以进样浓度（μg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程 Y=2.2891×103X+13.3322（r=0.9995）。结果表明，野黄芩苷进样浓度在21.8～130.8 μg/ml范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

在上述色谱条件下，精密吸取同一野黄芩苷对照品溶液10 μl，重复进样6次，结果6次测得野黄芩苷峰面积的RSD为0.88%，表明精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批号（批号：090201）的样品细粉6份，按照“2.2.2”项下样品制备方法制备并进样测定，每次进样10 μl，测定野黄芩苷平均含量。结果6份含量的RSD为1.34%，表明重复性较好。

2.7 稳定性试验

取同一批供试品溶液（批号：090201），分别于 0、1、2、4、6、8、10 h进样测定其中野黄芩苷的峰面积，结果RSD为1.67%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

精密称取约5 g已知含量的供试品（批号：090201，含量0.0851 mg/g）6份，分别精密加入野黄芩苷对照品适量，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，进行含量测定并计算回收率。见表1。

表1 回收率试验结果（n=6）

2.9 样品含量测定

取上述癌痛消颗粒 3批 （批号：090201、090202、090203），按“2.2”项下方法制备供试品溶液和对照品溶液，分别进样10 μl测定峰面积，按外标法计算含量，结果3批癌痛消颗粒中野黄芩苷的含量分别为0.0851、0.0874、0.0860 mg/g，RSD为1.72%。

3 讨论

3.1 提取溶剂选择

野黄芩苷（分子式：C21H18O12，分子量：462.37）为黄色针状结晶（在乙醇中），溶于碱和冰醋酸、吡啶，微溶于一般的有机溶媒，不溶于水。根据野黄芩苷的性质，选择甲醇作为提取溶剂。用甲醇将癌痛消颗粒溶解后发现溶液颜色很深，其中含有的杂质、色素较多，会对其含量测定有干扰，且易污染色谱仪。改为先用石油醚（60～90℃）除杂质，再用甲醇提取的方法，可除去油脂、蜡、叶绿素、挥发油、三萜类及游离甾体等化合物。

3.2 提取方法筛选

比较用甲醇超声提取和用甲醇索氏提取时的效果。称取同一样品两份，一份用100 ml甲醇进行索氏提取至无色，另一份用100 ml甲醇超声提取1 h，测定野黄芩苷含量。结果表明用索氏提取方法测得的野黄芩苷含量较高，因此拟定癌痛消颗粒用石油醚（60～90℃）除杂质后，加甲醇用索氏提取器回流提取，再浓缩定容。实验结果表明该法提取充分，测定的结果准确，故采用此法。

3.3 流动相的选择

因为野黄芩苷分子结构中羟基易电离而使色谱峰扩散，故应在流动相中加入少量酸抑制其色谱峰拖尾。曾采用甲醇-0.1%磷酸、甲醇-3%醋酸进行试验，前者的基线较平稳，峰型较好。以甲醇-0.1%磷酸（40∶60）作流动相时，野黄芩苷的保留时间为12.6 min，但在14.1 min时有杂质峰干扰其测定，调整流动相的比例为34∶66时两峰分开，野黄芩苷的保留时间为20.7 min，且峰型也较好，故用甲醇-0.1%磷酸（34∶66）作为流动相。

结果显示，本试验建立的癌痛消颗粒中野黄芩苷含量的测定方法，专属性较强，重复性较好，精密度较高，结果较为可靠，可作为该制剂质量控制方法。

[1]韦艾凌,唐健.癌痛消胶囊调节小鼠荷H22移植性肝癌细胞VEGF表达的实验研究[J].广西中医药,2004,27(4):47-49.

[2]王庆高,韦艾凌,徐志新.癌痛消胶囊调节小鼠荷H22移植性肝癌细胞VEGF,p53和p21ras表达的实验研究[J].广西中医药,2005,28(2):45-46.

[3]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:109.

[4]林敬明,刘煜,罗荣城.半枝莲抑制人肝癌QGY-7701细胞增殖研究[J].南方医科大学学报,2006,26(5):591-593.

[5]李萍,左甜甜,王晓秋,等.半枝莲化学成分的研究Ⅱ[J].中国药物化学杂志,2008,18(5):374-376.

[6]乔春峰,韩全斌,宋景政.RP-HPLC测定半枝莲药材中4种主要黄酮类成分的含量[J].中国药学杂志,2006,41(17):1342-1344.

[7]万丽丽,郭澄.野黄芩苷药动学研究进展[J].中国药房,2007,30(18):2385-2387.

[8]杨连梅,刘量,胡荣,等.半枝莲化学成分的提取和含量测定方法研究[J].江苏中医药,2010,42(2):78-79.

[9]程蓉.HPLC法测定欣力康颗粒剂中野黄芩苷的含量[J].中国药事,2004,18(10):628-630.

[10]王永林,郑林,王爱民,等.高效液相色谱法测定注射用辛芍中野黄芩苷含量[J].贵阳医学院学报,2008,30(1):32-34.