GnRH拮抗剂和激动剂联合应用对环磷酰胺化疗中卵巢功能保护的实验研究

李友生，陈江鸿

1.武汉市新洲区中医医院妇产科，湖北 武汉 430400；2.广西医科大学附属第四医院妇产科，广西 柳州 545005

化疗是肿瘤治疗中的重要手段之一，因其疗效确切，现已广泛应用于临床。但由于化疗药物缺乏选择性，对正常组织细胞也存在毒性作用。因此，环磷酰胺化疗过程中可引起致卵巢损害导致卵巢功能不全、不孕及早绝经，甚至出现卵巢功能早衰（POF），严重影响了年轻女性肿瘤患者的生活质量[1]。目前研究表明，GnRH-ant与GnRH-a对化疗引起的卵巢损害均具有保护作用[2-3]，但前者会导致雌激素一过性升高，后者会出现低雌激素效应，故单用均存在一定的局限性。本研究旨在通过动物实验探讨GnRH-ant与GnRH-a联合应用化疗中卵巢功能的保护作用及可能的机制，为其在临床上的应用寻求理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

8～9 周成年雌性 Balb/c 小鼠，体重（20±2）g，购自湖南斯莱克景达实验动物公司，以无特殊病原体（SPF）级鼠饲料和净化水喂养，室温22℃左右，相对湿度50%左右，明暗交替各12 h。于饲养1周后，每天阴道分泌物涂片观察性周期，将有正常性周期的大鼠纳入实验。CTX购于锦州九泰药业有限责任公司，GnRH-ant购自瑞士雪兰诺制药有限公司，GnRH-a购自天津博福-益普生制药有限公司。

1.2 方法

将纳入实验组的36只小鼠随机分成4组，A组为对照组，B组为 CTX组，C组为 GnRH-ant+GnRH-a组，D组为GnRH-ant+GnRH-a+CTX组，每组各9只。A组：生理盐水1 ml/d，连续腹腔注射20 d；B组：生理盐水1 ml/d，连续腹腔注射 10 d 后，给予 CTX 2.0 mg/（kg·d），连续腹腔注射 10 d；C 组：GnRH-ant 0.5 mg/（kg·d），GnRH-a 0.1 mg/（kg·d），连续皮下注射 20 d；D组：GnRH-ant与 GnRH-a连续给药 10 d后，给予GnRH-ant、GnRH-a与CTX连用10 d。给药期间，每天将阴道分泌物涂片以观察性周期。用药结束后于动情期处死小鼠，取其子宫及双侧卵巢，称取湿重后用4%多聚甲醛固定。

1.3 激素测定方法

采用放射免疫法测定小鼠血清中促卵泡生成素（FSH）、雌二醇（E2）的水平，试剂盒购自天津九鼎医学生物工程有限公司。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料数据以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验或成组资料单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠用药前后体重变化

用药前，各组小鼠体重比较差异无统计学意义（F=0.07，P＞0.05），用药后B组小鼠体重、子宫及卵巢湿重与其他三组比较显著减轻，差异有统计学意义（P＜0.05）；而C、D组与A组相比，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1、2。

表1 各组小鼠用药前后体重变化比较（，g）

表1 各组小鼠用药前后体重变化比较（，g）

注：与 B 组比较，t=5.37，①P＜0.05，t=4.26，②P＜0.05，t=5.58，③P＜0.05；与A 组比较，t=0.70，④P＞0.05；t=0.12，⑤P＞0.05

组别 例数A组B组C组D组9999用药前18.35±1.4317.89±1.2717.68±1.0318.52±1.59用药后19.44±1.52①16.23±0.9518.92±1.64②④19.36±1.39③⑤

表2 各组小鼠子宫及卵巢湿重比较（，mg）

表2 各组小鼠子宫及卵巢湿重比较（，mg）

注：与 B 组比较，t=19.00，①P＜0.05，t=17.36，②P＜0.05，t=18.28，③P＜0.05； 与 A 组比较，t=0.32， ④P＞0.05，t=0.25， ⑤P＞0.05。 与 B 组比较，t=34.00，aP＜0.05，t=29.06，bP＜0.05，t=26.30，cP＜0.05；与 A 组比较，t=0.37，dP＞0.05；t=0.29，eP＞0.05

组别 例数A组B组C组D组9999子宫湿重68.75±9.41①9.03±0.5467.28±10.05②④67.63±9.60③⑤卵巢湿重18.94±0.53a 8.28±0.7618.03±0.66bd 17.52±0.73ce

2.2 各组小鼠各级卵泡数量变化

用药后B组小鼠各级卵泡数均有所减少，尤其是生长卵泡、成熟卵泡及卵泡总数，与其他三组相比差异有统计学意义 （P＜0.05），而C组生长卵泡与成熟卵泡数较A组显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 3。

表3 各组小鼠子宫及卵巢湿重比较（，个）

表3 各组小鼠子宫及卵巢湿重比较（，个）

注：初级卵泡，a经t检验，与其他三组比较，tA=20.60、tC=8.46、tD=5.02，P＜0.05；生长卵泡，b 经 t检验，与其他三组比较，tB=13.50、tC=23.14、tD=23.86；成熟卵泡，c经t检验，与其他三组比较，tB=14.25、tC=12.16、tD=11.74；卵泡总数，d经t检验，与其他三组比较，tA=21.29、tC=21.36、tD=21.90；与 A 组比较，t=23.14，①P＜0.05，t=12.16，②P＜0.05

组别 例数 初级卵泡A组B组C组D组9999665.86±29.42349.45±35.47a 787.47±31.51743.25±35.64生长卵泡218.34±16.49b 124.58±12.7378.25±7.62①69.97±8.73成熟卵泡66.53±8.41c 23.23±3.5228.45±4.19②28.98±4.62卵泡总数818.23±42.33438.84±32.67d 858.94±49.12797.37±36.67

2.3 各组小鼠血清FSH和E2浓度

用药后B组小鼠血清FSH水平升高，E2水平下降，与其他三组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），而C、D组与A组相比，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 4。

表4 各组小鼠用药前后生殖激素水平比较（）

表4 各组小鼠用药前后生殖激素水平比较（）

注：与 B 组比较，t=9.23，①P＜0.05，t=6.59，②P＜0.05，t=6.67，③P＜0.05；与A 组比较，t=1.45，④P＞0.05，t=1.87，⑤P＞0.05；与 B 组比较，t=9.23，aP＜0.05，t=6.59，bP＜0.05，t=6.67，cP＜0.05； 与 A 组比较，t=1.90，dP＞0.05，t=1.95，eP＞0.05

组别 例数A组B组C组D组9999 FSH（IU/L）1.05±0.13①1.89±0.241.28±0.14②④1.32±0.09③⑤E2（pg/ml）49.45±1.58a 36.40±1.9250.93±1.73bd 51.07±1.92ce

3 讨论

化疗药物造成卵巢功能损伤的机制目前尚未完全清楚，通常认为，该类药物影响卵泡的生长发育与成熟过程，使卵泡受到破坏，卵泡总数下降，最终导致POF。CTX是临床上常用的抗肿瘤药，具有广谱、强效且无交叉耐药等特点，但同样对卵巢功能具有损伤作用。研究表明，GnRH-ant和GnRH-a可通过对促性腺功能的抑制达到保护卵巢功能的作用，但是其作用机制不同，前者可能为抑制性腺轴，阻止原始卵泡向成熟卵泡转变并处于药物低敏感状态[4]，后者主要通过与垂体受体的高度亲和，直接抑制内源性GnRH的作用[5]。

3.1 GnRH-ant和GnRH-a对生殖器官的影响

用药后CTX组小鼠体重、子宫与卵巢湿重较其他三组明显减轻，卵泡总数显著减少，尤其是生长卵泡与成熟卵泡，可能原因是CTX加速卵泡闭锁，过度凋亡，最终导致各级卵泡数量减少，子宫体积缩小，腺体萎缩和减少。CTX+GnRH-a+GnRH-ant组与GnRH-ant+GnRH-a组体重、子宫与卵巢湿重略低于对照组，而生长卵泡与成熟卵泡显著减少，初级卵泡与卵泡总数略高于对照组，提示GnRH-ant和GnRH-a联合应用可阻止初级卵泡的成熟，不损害静止期的卵泡，降低CTX对卵巢卵泡的敏感性，从而保护卵巢的储备功能[6-7]。

3.2 GnRH-ant和GnRH-a对血清FSH与E2的影响

FSH与E2的水平可作为卵巢储备功能的间接指标[8]。本研究结果显示，在CTX组小鼠中，FSH浓度显著升高，E2水平显著下降，可能是CTX对损伤卵巢颗粒细胞，使其无法分泌雌激素，进一步干扰下丘脑-垂体-卵巢轴，导致E2水平下降，FSH继发性升高。CTX+GnRH-a+GnRH-ant组与GnRH-ant+GnRH-a组小鼠中，血清FSH和E2水平与对照组比较差异无统计学意义，表明联合应用GnRH类似物可有效降低CTX对卵巢储备功能的损伤。其可能原因是GnRH-ant与竞争性抑制内源性GnRH对垂体的兴奋作用有关；GnRH-a使垂体性腺轴受抑制，阻止原始卵泡募集，形成低雌激素水平，而雌激素可抑制颗粒细胞凋亡，进而达到保护卵巢的目的。

综上所述，GnRH-ant和GnRH-a联合应用克服了单用GnRH-ant所致低雌激素状态及单用GnRH-a所致的垂体短暂的兴奋作用，优势互补，对化疗药物诱导的卵巢损伤具有一定保护作用，但其长期有效性与安全性仍需进一步临床观察。

[1]De Maio E,Adriano G,Carmen P,et al.Compliance and toxicity of adjuvant CMF in elderly breast cancer patients:a single-center experience[J].BMC Cancer,2005,5(1):30-31.

[2]袁光文,沈铿,杨佳欣.促性腺激素释放激素激动剂对化疗损伤卵巢功能保护作用的实验研究[J].中华妇产科杂志,2005,40(10):666-669.

[3]赵雪静,黄艳红.GnRH拮抗剂对化疗中卵巢的保护作用[J].中国妇幼健康研究,2007,18(4):337-339.

[4]崔蕾,陈建玲,雷小敏.促性腺激素释放素类似物预防化疗后卵巢早衰[J].河北医药,2007,29(7):743-744.

[5]王丹,惠宁.促性腺激素释放激素类似物在卵巢癌治疗中的应用[J].第二军医大学学报,2008,29(9):1102-1104.

[6]赵雪静,辛晓燕,黄艳红,等.促性腺激素释放激素拮抗剂预防化疗大鼠卵巢功能损害的实验研究[J].现代肿瘤医学,2008,16(6):896-900.

[7]彭萍,杨冬梓,郑澄宇,等.促性腺激素释放激素激动剂在化疗患者卵巢功能保护中应用的研究进展[J].中华妇产科杂志,2006,41(4):139-141.

[8]李媛,陈子江.卵巢储备能力的预测[J].现代妇产科进展,2002,11(1):56-58.