针刺督脉对脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡和Caspase-8蛋白表达的影响

罗文舒，饶晓丹，吴永刚，曹雪梅，于海波，皮 敏，杨卓欣，刘远声

广东省深圳市中医院针灸科，广东 深圳 518033

缺血性脑血管病是严重危害我国人民健康的疾病[1-2]，缺血再灌注损伤是其常见的病理过程，细胞凋亡是其重要的病理环节。半胱氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）是介导两条主要凋亡途径的关键性的酶，凋亡信号传递至Caspase-8可使之活化，从而启动凋亡的级联反应。针灸作为脑梗死的有效治疗手段，在其病理过程中可起重要作用。本研究观察针刺督脉经穴对脑缺血细胞凋亡和Caspase-8蛋白表达的影响，探讨针刺督脉经穴脑保护作用的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组

以 SD 大鼠为受试对象，雄性，体重（200±30）g。实验室温度控制在22～28℃之间。将实验动物随机分为假手术组、模型组、针刺对照组、针刺督脉组4组，各30只。

1.2 造模方法

实验动物以10%水合氯醛腹腔麻醉（35 mg/100 g体重），仰卧于手术台，参考Kuge造模法[3]，局部常规消毒，颈正中切开，先后分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA），离断 ECA的分支，结扎并游离 ECA主干一段。在游离出的ECA剪一小口，将制备好的尼龙线（直径0.205 mm）插入ECA内，经CCA分叉处通过ICA至大脑前动脉（ACA），尼龙线插入深度平均为（18.5±0.5）mm，以完全阻断右侧大脑中动脉（MCA）血供。缺血2 h时向外拉尼龙线使其球端回至ECA内，此时即可恢复右侧MCA血供，形成缺血再灌注。

1.3 治疗参数

假手术组和模型组于术后即如针刺组大鼠般固定于针刺操作台上20 min，不做任何治疗，每12小时1次。针刺对照组和针刺督脉组术后即予针刺，持续时间为20min，每12小时1次。穴位定位参考人民卫生出版社1997年第1版《实验针灸学》中大鼠的百会、风府、气海、关元取穴方法。将大鼠固定，针刺后采波10 Hz），电压3～5 V，电流1 mA，以身体出现轻微颤动为准。

1.4 取材

受试动物再灌注后 3、6、12、24、72 h后处死，每组每个时间段处死6只。10%水合氯醛腹腔过量麻醉，以生理盐水灌注，再以4%多聚甲醛内固定，取出脑组织，4%多聚甲醛固定24～48 h，转入30%蔗糖溶液至沉底，石蜡包埋切片备用。

1.5 观察指标

1.5.1 脑组织凋亡细胞的原位检测 （TUNEL法）切片以1%的过氧化氢处理10 min，加0.01 M TBS 1:200新鲜稀释蛋白酶K 37℃消化1 min，每片切片取末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）和 DIG-d-UTP 各 1 μl，加入 18 μl标记缓冲液中混匀。甩去片上多余液体后加标记液20 μl/片。置样品于湿盒中，37℃标记2 h。加封闭液 50 μl/片，室温 30 min，加抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体50 μl/片，37℃反应30 min，SABC（1:100）50 μl/片加至标本片上，37℃反应 30 min，DAB 显色，脱水、透明、封片，镜检。

表1 各组大鼠脑组织凋亡细胞原位检测阳性细胞数（，个）

表1 各组大鼠脑组织凋亡细胞原位检测阳性细胞数（，个）

注：与假手术组比较，①P＜0.01；与组内其他时间段比较，②P＜0.01；与模型组比较，③P＜0.01

组别 只数 3 h（n=6）假手术组模型组针刺对照组针刺督脉组303030302.34±0.6214.54±3.18①11.85±3.5210.43±2.836 h（n=6）2.51±0.2717.62±2.73①16.85±4.1914.87±3.2612 h（n=6）2.42±0.3329.47±4.29①27.43±3.4126.18±2.7224 h（n=6）2.78±0.3648.75±3.61①②35.68±2.74③37.81±4.12③72 h（n=6）2.65±0.525.14±1.25①4.35±1.814.84±1.32

表2 各组大鼠脑组织顶叶皮层Caspase-8蛋白表达的平均灰度值（）

表2 各组大鼠脑组织顶叶皮层Caspase-8蛋白表达的平均灰度值（）

注：与假手术组比较，①P＜0.01；与组内其他时间段比较，②P＜0.05；与模型组比较，③P＜0.05

组别 只数 3 h（n=6）假手术组模型组针刺对照组针刺督脉组30303030175.24±12.32153.41±10.34①158.76±14.53159.52±12.736 h（n=6）178.72±9.53141.52±11.36①150.16±13.62148.61±10.9612 h（n=6）173.51±13.86129.28±7.51①②138.83±13.85141.54±12.8424 h（n=6）176.27±11.92145.43±8.93①159.32±10.23③162.72±11.63③72 h（n=6）179.67±14.45156.52±7.48①169.28±11.97③171.42±14.49③

1.5.2 免疫组织化学染色 （SABC法）检测Caspase-8表达：用Caspase-8多克隆抗体进行SABC免疫组织化学染色，采用捞片法，每只实验动物每个脑区取4张切片。切片常规脱蜡至水，30%H2O21份加蒸馏水10份混合，室温5～10 min以灭活内源性酶，抗原热修复，滴加兔抗Caspase-8多克隆抗体（1:100）20℃ 2 h，4℃过夜，滴加生物素化山羊抗兔 IgG，室温20 min，滴加链霉素亲和素一生物素复合物（SABC，1:100），室温下孵育2 h，DAB显色，脱水，透明，封片，镜检。

1.6 统计学方法

采用SPSS 11.0软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，重复测量的计量资料采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 针刺督脉经穴对脑缺血细胞凋亡的影响

实验结果表明，在各观察时间点，相对假手术组，大脑中动脉栓塞（MCAO）后凋亡细胞明显增多；在MCAO 24 h后，针刺督脉组与模型组比较，凋亡细胞数明显减少（P＜0.01）；针刺督脉组与针刺对照组比较，凋亡细胞数差异无统计学意义（P＞0.05）。 结果参见表 1。

2.2 针刺督脉经穴对脑缺血脑组织Caspase-8蛋白表达的影响

实验结果表明，与假手术组比较，模型组在各时间点Caspase-8蛋白表达的平均灰度值降低，提示Caspase-8蛋白阳性细胞数增多，在MCAO 12 h其平均灰度值降至最低点，其后时间点其平均灰度值又有所升高；在MCAO 24 h和72 h，针刺督脉组与模型组比较，Caspase-8蛋白表达的平均灰度值提高（P＜0.05），与针刺对照组比较，平均灰度值差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表 2。

3 讨论

脑细胞对缺血缺氧非常敏感，脑梗死后，梗死灶中心区以细胞死亡为主，而周边半暗区病理改变以细胞凋亡为主，挽救半暗区缺血缺氧的脑细胞，对减轻缺血再灌注损伤具有重要意义。

脑梗死后的细胞凋亡的机制非常复杂，Caspase家族在其中发挥了重要作用。凋亡过程虽然可由多种因素启动，但凋亡通路却相对保守，可分为外源性和内源性凋亡通路，二者都通过关键的Caspase-8蛋白调控凋亡过程[4]。实验表明，脑梗死后Caspase-8蛋白表达水平上升，这一过程与脑细胞凋亡的发生发展过程基本相符，提示致病因素引起的Caspase-8水平改变与脑细胞凋亡的病理过程密切相关。

针灸应用于中风急性期治疗，在脑保护方面越来越引起人们的关注[5]，临床上重视应用督脉和任脉经穴治疗中风病，取得了很好的疗效[6]。《难经·二十八难》云“督脉者起于下极之腧，并于脊里，上至风府，入属于脑”，《素问·骨空论》曰督脉“上额交巅上，入络脑”，明确指出督脉在循行上与脑密切相关。督脉为阳脉之海，同时与诸经交汇，通过将十四经脏腑气血上输于脑，以奉养元神，可见督脉对脑功能的正常发挥具有重要意义。故历代医家多应用督脉经穴治疗中风所引起的神志障碍、言语肢体功能障碍等。而任脉为阴脉之海，与督脉共同协调机体阴阳功能。从实验结果可以看出，针刺督脉治疗在脑梗死24 h即可减少凋亡细胞数，在脑梗死24 h和72 h即可下调其Caspase-8蛋白表达，而针刺任脉经穴亦有类似效果，提示针刺督脉治疗脑梗死，可能通过调节Caspase-8表达水平，减少脑细胞凋亡，从而对脑缺血再灌注损伤起脑保护作用。

[1]汪关宝,杨少琴,史影,等.北京市中关村地区心脑血管病病死率及防治策略的流行病学研究[J].心肺血管病杂志,2010,29(4):261-265.

[2]李云鹏,柳胜生,苏旭燕,等.上海市松江区2001-2008年脑卒中流行病学分析[J].上海预防医学杂志,2010,22(1):22-24.

[3]Kuge Y,Minematsu K,Yamagachi T,et al.Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats [J].Stroke,1995,26(9):1665.

[4]Kischkel FC,Lawrence DA,Chuntharapai A,et al.Apo2L/TRAIL-dependent recruitment of endogenous FADD and caspase-8 to death receptor 4 and 5[J].Immunity,2000,12:611-620.

[5]王鹏琴,白丽,蔡虹,等.眼针对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织半暗区Caspase-8、Caspase-3 mRNA表达的影响 [J].针灸临床杂志,2010,26(9):51-54.

[6]罗文舒.针灸任督脉治疗中风后尿失禁的临床研究[J].广西中医学院学报,2009,12(1):12-14.