CXCR4和VEGF－C在胃癌中的表达及与临床病理因素的关系

李利义 罗 越 郑志强 徐 斌 董剑达 韩绍伟

胃癌在世界范围内的发病率居恶性肿瘤第2位，占消化道恶性肿瘤的首位。淋巴结转移和腹膜转移是其最常见的转移方式，是进展期胃癌预后不佳的主要原因。随着对血管内皮生长因子－C(vascular endothelial growth factor C，VEGF－C)研究的深入，VEGF－C诱导胃癌淋巴转移及腹膜转移已成为人们关注的焦点。趋化因子与肿瘤转移的相关性是近些年国内外研究的热门之一。新近研究表明趋化因子特别是CXCR4(chemokine CXC receptor 4)及其配体所构成的信号传导通路参与调控细胞内肌动蛋白聚合，骨架重排，伪足形成，细胞运动，与肿瘤器官特异性转移密切相关［1］。我们应用免疫组化方法检测人胃癌中 CXCR4、VEGF－C的表达，探讨 CXCR4与VEGF－C表达的相关性，及其与胃癌临床病理因素的关系。

材料与方法

1.材料:收集笔者医院外科2008年7月～2010年5月间手术治疗的胃癌患者50例，其中男性28例，女性22例，年龄分布35～80岁，中位年龄61岁，所有患者术前均经病理学证实，均未接受放疗或化疗。按照日本胃癌协会(JGCA)2010年TNM分期标准分期，50例胃癌中Ⅰ期6例、Ⅱ期10例、Ⅲ期22例、Ⅳ期12例。术后病理:高、中分化癌27例，低分化或未分化癌23例;无淋巴结转移者12例，伴有淋巴结转移数者38例。50例病例中术后病理学证实有10例发生腹膜转移。术后10min内每份标本取材于肿瘤组织(T)及远切端正常胃黏膜组织(N)，全部标本取材后迅速置－80℃冰箱保存备用。

2.试剂:免疫组织化学SP试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。兔抗人VEGF－C试剂盒为北京中山生物技术有限公司产品。鼠抗人CXCR4为武汉博士德生物工程有限公司产品。其他常规试剂均为国产分析纯。

3.方法:(1)CXCR4和VEGF－C蛋白表达的检测:采用链霉菌抗生素蛋白－过氧化酶染色法。石蜡切片脱蜡，以微波枸橼酸盐进行抗原修复，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明封片，显微镜下观察，用已知的阳性切片作为阳性对照，用PBS代替Ⅰ抗，作为阴性对照。(2)结果判定标准:在组织切片中CXCR4和VEGF－C阳性细胞主要表现为细胞质、细胞膜染为棕黄色。判定标准:采用双盲法计数10个高倍视野，阳性细胞数＜10%为阴性，≥10%为阳性，同时忽略较弱或可疑的染色。

4.统计学方法:数据采用SPSS 17.0软件包进行分析。根据数据类型选择χ2检验和Spearman相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.胃不同组织中CXCR4和VEGF－C的表达情况:在胃正常组织中未见CXCR4蛋白表达。在50例胃癌组织中，有31例CXCR4表达阳性(图1)，表达率为62%。两者有显著性差异(P＜0.01)。在30例胃正常组织中，有2例VEGF－C蛋白表达，表达率为6.67%。在50例胃癌组织中，有36例VEGF－C表达阳性(图2)，表达率为72%。两者有显著性差异(P ＜0.05)。

图1 胃癌组织CXCR4阳性表达(×400)

图2 胃癌组织VEGF阳性表达(×400)

2.CXCR4和VEGF－C表达与胃癌临床病理因素的关系:胃癌组织中CXCR4和VEGF－C表达水平与肿瘤组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移、腹膜转移及TNM分期密切相关(P＜0.05)，而与患者性别、年龄及肿瘤大小等无关(P＞0.05)(表1)。

表1 CXCR4和VEGF－C表达与胃癌临床病理因素的关系

3.胃癌组织CXCR4表达与VEGF－C表达之间的相关关系:50例胃癌组织中，CXCR4和VEGF－C同时阳性表达的有29例，同时阴性表达的有12例，经Spearman相关分析显示，胃癌组织CXCR4表达与VEGF－C 表达呈显著正相关(К =0.597，P ＜0.01)，见表2。提示在胃癌的发展过程中，CXCR4和VEGF－C的高表达具有协同促进作用。

表2 胃癌组织CXCR4表达与VEGF－C表达的关系(n)

讨 论

在肿瘤中趋化因子发挥多种作用，包括控制白细胞浸润至肿瘤、调节肿瘤相关的血管生成、激活宿主对肿瘤的特异性免疫应答、以自分泌或旁分泌方式刺激肿瘤细胞增殖、控制肿瘤细胞运动等。近年来不少研究指出，趋化因子CXCL12与其特异性受体CXCR4所构成的CXCL12－CXCR4生物学轴在多种肿瘤的播散和器官特异性转移中发挥着重要的作用。CXCR4是神经纤毛蛋白－1(neuropilin－1，NRP－1)的下游分子，是一个编码352个氨基酸且高度保守的G蛋白偶联7次跨膜受体。CXCR4广泛表达在于血液、免疫和中枢神经系统细胞中。

Muller等［2］首次报告人乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中高表达趋化因子受体CXCR4，而在乳腺癌最常见的转移部位如淋巴结、肺、肝脏和骨髓则高表达其配体CXCL12。在严重联合免疫缺陷的小鼠用抗CXCR4的单克隆抗体能有效地抑制人乳腺癌移植瘤的肺转移，其抑制率高达61% ～82%，提示趋化因子及其受体的同步高表达在决定乳腺癌器官特异性转移的过程中起着非常关键的作用。Kazuo Yasumoto等［3］用免疫组化方法检测胃癌组织中CXCR4的表达，结果伴有腹膜转移的胃癌组织中CXCR4的阳性率为67%，显著高于无腹膜转移者(25%)。随后有关CXCL12－CXCR4生物学轴在其他肿瘤，如非小细胞肺癌、肝癌和结肠癌等转移发生过程中的作用的研究也相继开展，并且在各种体内外实验中也得到了证实［4，5］。

我们应用免疫组化的方法，检测人体胃不同组织中CXCR4的表达情况。结果表明，正常胃组织不表达CXCR4，而在胃癌组织中，阳性表达率为62%，差异有统计学意义，提示CXCR4可能与胃癌的发生、发展有关。在无淋巴结转移的胃癌组织中，CXCR4阳性表达率为25%，而伴有淋巴结转移的胃癌组织中，CXCR4阳性表达率为73.68%，两者有显著差异。伴有腹膜转移的胃癌组织中CXCR4表达率为100%，显著高于无腹膜转移者52.5%。以上结果提示趋化因子受体CXCR4的表达可能促进胃癌的淋巴结转移和腹膜转移，这与王正林等［6］的研究结果一致。

血管内皮生长因子－C是新生血管形成的重要调控因子，在肿瘤的发生发展中起关键作用。VEGF－C能特异性作用于血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖、增加血管通透性，诱导肿瘤血管生成，而新生血管又为肿瘤细胞生长提供营养并间接促进肿瘤细胞增殖［7］。本实验结果显示，正常胃组织中VEGF－C的阳性表达率为6.67%，胃癌组织VEGF－C的阳性表达率显著升高达72%，差异有统计学意义，提示VEGF－C可能与胃癌的发生、发展有关。

分析CXCR4和VEGF－C的表达与胃癌临床病理因素的关系发现，低分化及未分化的胃癌组织的CXCR4和VEGF－C的阳性表达率明显高于高分化及中分化者，并且随着肿瘤的侵袭深度、淋巴结转移、腹膜转移、临床分期的增加，CXCR4和VEGF－C的表达率也明显增加。以上结果提示CXCR4和VEGF－C的高表达可能是胃癌预后不良的重要分子标志［8］。CXCR4和VEGF－C的检测有望成为胃癌分子诊断和病期评估的标志之一。

我们研究了胃癌组织中CXCR4和VEGF－C表达的相关性，实验结果经Spearman等级相关分析表明两者表达指数正相关(P＜0.01)，说明两者在胃癌的发展中存在协同作用。其可能机制有:①Tao等［9］发现VEGF－C和NRP－1结合可以增强肿瘤的存活能力和侵袭活性。所以我们认为，VEGF－C可能通过某种机制调节CXCR4的产生或表达，形成VEGF－C－NRP－1－CXCR4信号通路，协同促进肿瘤细胞向特定器官转移;②抑制肿瘤细胞凋亡:高表达的VEGF可通过诱导趋化因子受体过度表达介导内皮细胞移行并抑制凋亡;③促进肿瘤血管形成:Liang等［10］研究发现，CXCR4和 VEGF－C的协同作用能促进脑肿瘤微血管内皮细胞的迁移并抑制其凋亡，而且在体内用CXCR4抑制剂可以抑制肿瘤生长和血管形成。下一步本课题组将采用抗CXCR4的单克隆抗体阻断CXCR4表达以控制胃癌的转移。这对于胃癌的转移，特别是在对腹膜种植转移的防治上，可能提供一个新的分子靶标。

1 Kucia M，Reca R，Miekus K，et al.Trafficking of normal stem cells and metastasis of cancer stem cells involve similar mechanisms:pivotal role of the SDF－1－CXCR4 axis［J］.Stem Cells，2005，23(7):879－894

2 Muller A，Homey B，Soto H，Ge N，Catron D，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis［J］.Nature，2001，410:50－56

3 Kazuo Yasumoto，et al.Role of the CXCL12/CXCR4 axis in peritoneal carcinomatosis of gastric cancer［J］.Cancer Res，2006，66(4):2181－2187

4 Xiang Z，Zeng Z，Tang Z，et al.Increased expression of vascular endothelial growth factor－C and nuclear CXCR4 in hepatocellular carcinoma is correlated with lymph node metastasis and poor outcome［J］.Cancer J，2009，15(6):519－25

5 王磊，李健文，冯波，等.趋化因子受体CXCR4在结肠直肠癌中的表达及意义［J］.外科理论与实践，2009，14(2):189－192

6 王正林，胡祥，梁品等.趋化因子受体CXCR4在胃癌中的表达及其意义［J］.中华普通外科杂志，2009，18(12):1275 －1279

7 Detoraki A，Staiano RI，Granata F，et al.Vascular endothelial growth factors synthesized by human lung mast cells exert angiogenic effects［J］.J Allergy Clin Immunol，2009，123(5):1142 －1149

8 Woo IS，Hong SH，Byun JH，et al.Circulating stromal cell derived factor－1 is predictive of distant metastasis in gastric carcinoma［J］.Cancer investigation，2008，26:256 －261

9 Tao J，LI T，Li K，et al.Effect of HIF －1 alpha on VEGF－C induced 1ymphangiogenesis and 1ymph nodes metastases of pancreatic cancer［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2006，26(5):562－564

10 Liang Z，Brooks J，Willard M，et al.CXCR4/CXCL12 axis promotes VEGF－mediated tumor angiogenesis through Akt signaling pathway［J］.Biochemical and Biophysical Res Communications，2007，359(3):716－722