非酒精性脂肪性肝病患者血清细胞角蛋白18片段水平的变化

蔡文品 吴惠洁 陈 洁

随着人们生活水平的提高与饮食结构的改变，肥胖、高血压、高血脂、2型糖尿病等发病率的增加，非酒精性脂肪性肝病(non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD)患病率在中国呈逐年提高且增幅越来越快的趋势，现在NAFLD是除乙型病毒性肝炎外最重要的慢性肝病，对人们的健康构成了严重的威胁。有关NAFLD的发病机制，Day等提出的二次打击学说已得到公认，近年随着对细胞凋亡的深入研究，不断有证据表明凋亡在非酒精性脂肪性肝病的发生发展中起重要的作用［1～4］，在凋亡发生过程中肝细胞骨架蛋白之一细胞角蛋白18被半胱天冬蛋白酶(caspase)分解成不同片段，其中暴露出的含Asp396特异性结合位点(M30抗原)的细胞角蛋白18片段水平代表肝细胞凋亡水平，该片段在外周血中可稳定存在。检测NAFLD患者血清中凋亡产生的细胞角蛋白18片段水平的变化在诊断治疗中的作用值得探讨［5］。

对象与方法

1.研究对象:按照2006年2月中华医学会肝脏医学分会制定的非酒精性脂肪性肝病临床诊断与分型为标准选取2009年4月～2010年2月间来笔者医院进行健康体检者中的NAFLD患者136例。其中非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者47例，男性31例，女性16例，年龄27～62岁(45.6±17.3岁);非酒精性单纯性脂肪肝(NAFLD)患者89例，男性59例，女性30例，年龄26～68岁(50.3±19.2岁)。对照者为经B超、实验室等相关检查显示均正常的健康体检者，40例，男女性别比例与年龄构成与病例组相匹配。所有入选者均需除外急慢性病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、色素沉着病、胆管炎患者，近期服用雌激素、甾体类激素、中草药患者也除外。

2.方法:记录所有入选者姓名、性别、年龄、身高、体重、既往史、B超检查结果，于清晨空腹抽取肘静脉血6ml，1h内分离血清存于－70℃冰箱备用。

常规生化项目 ALT、AST、γ －GT、GLU、TCH、TG、HDL －C、LDL－C的检测，仪器为雅培C8000全自动生化仪，试剂为日本和光的;病毒性肝炎检查(包括甲肝抗体、乙型肝炎两对半定性、丙型肝炎抗体、丁型肝炎抗体、戊型肝炎抗体、庚型肝炎抗体)用ELISA法，酶标仪为BIO－RAD的model－680，试剂由上海科华生物工程股份有限公司提供;自身相关抗体ANA、ENA的检测采用免疫间接荧光法，试剂由欧蒙(杭州)医学实验诊断有限公司提供，主要仪器为荧光显微镜，所有操作严格按仪器的SOP要求进行。

细胞角蛋白18片段水平的检测，用ELISA法定量测定，试剂由CUSABIO生物技术公司提供的，酶标仪读取吸光度OD值后通过Curve Expert 1.3软件来计算结果。

3.统计学方法:用SPSS 13.0软件进行统计分析，所有数据以表示，方差分析组间指标差异性，Pearson统计分析CK－18片段水平与其他生化指标的相关性，P＜0.05为有统计学意义。

结 果

1.各组基本临床资料信息:见表1。实验室检测结果、细胞角蛋白18片段水平的结果及比较:见表2。

表1 非酒精性脂肪性肝病患者各组基本临床信息

表2 非酒精性脂肪性肝病患者实验室检测结果与分析

2.细胞角蛋白18片段水平与ALT、AST、γ－GT、TCH、TG的相关性分析结果分别为 r=0.473，P＜0.01;r=0.472，P ＜ 0.01;r=0.428，P ＜ 0.01;r=0.017，P ＞0.05;r=0.319，P ＜0.05。

讨 论

非酒精性脂肪性肝病是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征，主要包括非酒精性单纯性脂肪肝与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，后者更容易发展成肝纤维化、肝硬化甚至肝癌，预后较差，研究表明临床上已发展为NASH的患者缺乏明确特异性的体征与症状且临床表现与肝脏病变严重程度无相关，因此尽早诊断NAFLD并分型非常重要。目前肝活检仍然是诊断NAFLD的唯一金标准，但其具有一定的创伤性，此外穿刺技术、取材部位对结果准确性有一定的影响以及不同短时间内无法反复进行，不适合临床常规应用。影像学诊断NAFLD灵敏度、特异性都不高，且存在较高的漏诊率。寻找非创伤性的诊断指标显得非常必要且迫切。

在非酒精性脂肪性肝病发病机制研究方面近年来诸多临床研究与动物试验表明细胞凋亡在其发生发展中扮演重要的角色［6］。CK－18是肝细胞骨架蛋白之一，在肝细胞发生凋亡的过程中caspase酶分解肝细胞角蛋白18暴露出特异的Asp396结合位点的蛋白片段，而肝细胞坏死不会产生这种细胞角蛋白18片段，因此特异地检测这种肝细胞角蛋白18片段水平可较好地反映了肝细胞凋亡的程度［5］。本研究结果显示了非酒精性脂肪性肝病患者血清凋亡产生的CK－18片段水平显著高于正常对照者，且NAFLD组内NASH患者CK－18片段水平显著高于NAFLD患者，证实了肝细胞凋亡参与了非酒精性脂肪性肝病的发生发展;更为重要的是单纯性脂肪肝患者的ALT、AST指标均在正常范围内，与健康对照者间无显著性差别，可单纯性脂肪肝患者的血清CK－18片段水平显著高于健康对照者，此外NAFLD患者血清凋亡产生的CK－18片段水平与ALT、AST、γ－GT间存在良好的相关性，r值分别为 0.473、0.472、0.428，表明CK－18片段具有与肝功能相关指标如ALT、AST、γ－GT等同样的价值，可用于NAFLD的诊断以及NASH与非酒精性单纯性脂肪肝的区分。

总之凋亡产生的肝细胞角蛋白18片段一定程度上代表肝脏细胞凋亡的发生，深入研究并联合应用该蛋白片段与非酒精性脂肪性肝病其他诸多发生机制如胰岛素抵抗、氧化应激等相关细胞因子、脂肪细胞因子有望探索出用于NAFLD的新的非创伤性诊断模式。

1 Wieckowska A，Zein NN，Yerian LM，et al.In vivo assessment of liver cell apoptosis as a novel biomarker of disease severity in nonalcoholic fatty liver disease［J］.Hepatology，2006，2(44):27－33

2 Nishitani Y，Okazaki S，Imabayashi K，et al.Saturated and monounsaturated fatty acids increase interliukin－10 production in rat hepatocytes［J］.Nikon Arukoru Yakubutsu Igakkai Zasshi，2007，42(5):32 －35

3 范建高，钟岚，王国良，等.肥胖、高脂血脂性脂肪性肝炎细胞凋亡的实验研究［J］.中华消化杂志，2000，20(3):421 －422

4 Mitchell C，Mallet V，Guidotti JE，et al.Experimental modulation of apoptosis:physiopathological and therapeutic targets［J］.J Soc Biol，2005，199:243 －246

5 Alberto Grassi，Micaela Susca，Silvia Ferri，et al.Detection of the M30 neoepitope as a new tool to quantify liver apoptosis［J］.Am J Clin Pathol，2004，121:211－219

6 南月敏，胡云龙，付娜，等.Bad、Bax和Bid蛋白表达在非酒精性脂肪性肝炎中的作用［J］.世界华人消化杂志，2008，16(1):81－85