茶多酚、MTAD和次氯酸钠液抑制粪肠球菌及其生物膜的作用比较

李新军，郭晓丽，孙应明，陆伟，程玮

(解放军101医院口腔科，江苏 无锡 214044)

牙髓感染是由很多条件致病菌引起的，这些致病菌侵入到有死髓组织的根管内，将会建立一个感染过程［1］。当根管受到持续性感染时，兼性厌氧菌数目便会明显增加［2］。粪肠球菌是一种兼性G+厌氧球菌，属于肠球菌属，通常可以在感染牙髓中被发现，特别在一些继发性和持续性感染的根管中很容易被分离出来［3］。粪肠球菌在根管中比其他的细菌具有更强的生存能力，可以抵制各种不利的应激条件，如碱性环境、胆盐、饥饿和许多抗菌剂等［3－5］。因此，粪肠球菌在根管中很难被完全杀灭。

在牙髓治疗过程中，除根管预备的机械清理可以去除很多致病菌外，根管冲洗液的抗菌性也起着至关重要的作用，目前国内外比较常用的根管冲洗液有次氯酸钠、洗必泰、MTAD等［6］。其中 MTAD是一种由多西霉素，柠檬酸和吐温80组成的的根管冲洗液，具有很好的抑菌性，经常被用来去除根管沾污层，而不会过度侵蚀牙本质［7］。次氯酸钠液在去除粪肠球菌生物膜方面虽然比MTAD更有效［8］，但是同时也存在异味、高毒性和去除沾污层不佳等缺陷。临床上这些常用的根管冲洗液虽都有一定的抗菌效果，但可能都存在一定的缺陷，加之更多的耐药菌株出现和其他方面的不良作用促使研究者把目光转向毒副作用小的中药。本研究旨在比较茶多酚、MTAD和52.5 g/L次氯酸钠液去除根管内粪肠球菌生物膜的能力。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

粪肠球菌ATCC29212(第四军医大学口腔医院口腔内科学实验室提供);脑心浸液培养基(BHI，Difco公司，美国);茶多酚粉剂(西安托克生物科技有限公司，用时取0.6 g溶于10 mL 10%二甲基亚甲砜中);多西霉素(Sigma公司，美国);柠檬酸(分析纯，天津天大化学试剂厂);吐温80(Sigma公司，美国);52.5 g/L次氯酸钠(天津天大化学试剂厂);MTAD液(称取多西霉素3 g，柠檬酸4.25 g溶于蒸馏水中，再加入0.5 mL吐温80混匀，100 mL定溶;厌氧培养箱(上海博泰实验设备有限公司)。

1.2 3种根管冲洗液对粪肠球菌的抗菌性检测

1.2.1 细菌培养

冻存的粪肠球菌ATCC29212常规复苏后，划线接种于BHI平板培养基，置厌氧培养箱中，37℃厌氧(800 mL/L N2、100 mL/L CO2、100 mL/L H2)培养24 h，挑取克隆菌落转种于BHI液体培养基中，继续厌氧培养12 h，至平台期备用。

1.2.2 抗菌性检测

取培养至平台期的粪肠球菌菌液涂布于BHI平板培养基表面，再分别将浸有10 μL 6 mg/mL茶多酚液、MTAD液、52.5 g/L次氯酸钠液以及生理盐水(阴性对照组)的滤纸片(D:6 mm)贴于BHI培养基表面，置于厌氧箱中37℃厌氧培养过夜，观察抑菌圈大小。参照Tong等［9］的研究方法，通过微孔板滴定法检测茶多酚、MTAD和52.5 g/L次氯酸钠液对粪肠球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。最小抑菌浓度为含有最小浓度抗菌剂的培养液中接种细菌培养24 h后，可抑制细菌的生长;最小杀菌浓度为含有最小浓度抗菌剂的培养液中接种细菌培养24 h后，细菌的存活率降至0.1%以下。每个实验重复3次。

1.3 3种根管冲洗液对粪肠球菌生物膜的作用

1.3.1 生物膜根管感染模型建立

收集正畸减数拔除的单根下颌前磨牙120个，去除表面软组织和牙石，用金钢砂片在釉牙骨质界处截除牙冠，取长度约为8 mm的牙根用Protaper根管锉预备根管至F3，预备过程中用2 mL 10 g/L次氯酸钠液进行冲洗。预备完成的所有牙根均纵向剖开，经121℃高温，高压条件下消毒10 min后，分别放入24孔平板中(每孔中1个剖开的根管标本，根管壁内面朝上)，每孔加入2 mL BHI培养液，接种配制的粪肠球菌菌悬液，37℃厌氧培养，使根管内壁形成生物膜。120个标本随机分为2组，每组60个，分别培养3周和6周。培养过程中每3 d更换1次培养液，并用接种环取各孔少许菌液进行革兰氏染色，同时接种于BHI琼脂表面厌氧中培养24 h，观察菌落形态，以鉴定粪肠球菌培养液的纯度。

1.3.2 抗生物膜检测

将粪肠球菌感染3周和6周的标本各随机分成4组(茶多酚处理组、MTAD处理组、52.5 g/L次氯酸钠液处理组和生理盐水处理组)，每组15个，分别用3 mL相应根管冲洗液处理10 min。然后在每组中随机选取5个标本，刮取根管内壁的生物膜用1 mL无菌PBS液分散后，取100 μL接种于BHI琼脂培养基表面进行活菌检测。每组剩余的另10个标本置生理盐水中充分振荡5 min后，10倍梯度稀释，进行铺板计数。

1.4 统计学分析

用SPSS 15.0统计软件对4组抑菌圈和细菌计数进行单因素方差分析，两两比较用Tukey’s HSD检验，检验水准α=0.05。

2 结果

纸片扩散法显示3种根管冲管冲洗液均有明显的抑菌圈，其中52.5 g/L次氯酸钠液抑菌圈最大，MTAD次之，茶多酚最小，次氯酸钠液组和MTAD组无统计学差异(P＞0.05)，但两者与茶多酚组比较，均有统计学差异(P＜0.05)。作为空白对照的生理盐水组没有出现抑菌圈(表1)。

3种根管冲洗液对粪肠球菌生物膜作用定性分析结果显示，无论是感染3周形成的生物膜，还是6周形成的生物膜，用MTAD和次氯酸钠液处理后取样培养均无细菌生长，而用茶多酚和生理盐水处理组取样培养均有细菌生长;定量检测结果显示:对于3周生物膜，茶多酚和生理盐水处理后，粪肠球菌计数分别为(1482±67.2)CFU/mL和(143.4±8.1) ×109CFU/mL，两者之间具有统计学差异(P＜0.05)，而MTAD和次氯酸钠液两处理组均无细菌生长;对于6周生物膜，相对于生理盐水处理的对照组，3种根管冲洗液组细菌计数均明显降低(P＜0.05)，其中次氯酸钠液处理组最好，仍无细菌生长，其次为MTAD组，茶多酚组细菌数最高，各组间相比差异均有统计学意义(P＜0.05)(表2)。

表1 3种根管冲洗液对粪肠球菌的抑菌性检测

表2 3种根管冲洗液对根管壁3周和6周粪肠球菌生物膜处理后的活菌定量分析(CFU/mL，)

表2 3种根管冲洗液对根管壁3周和6周粪肠球菌生物膜处理后的活菌定量分析(CFU/mL，)

不同字母组间P＜0.05

冲洗液 3周生物膜 6周生物膜茶多酚 1482±67.2a 1795±167a MTAD 0b 1401±125b次氯酸钠 0b 0c生理盐水 143.4 ×109± 8.1×109 c 138.9×109±18.3 ×109 d

3 讨论

粪肠球菌是持续性感染根管中最常被分离出的细菌之一，由于该菌具有极强的生存能力，且对多数普通抗生素均具有一定耐药性，常与根管治疗术失败密切相关。尤其当粪肠球菌以生物膜方式生长时，更具有抗药作用。有研究表明生物膜状态下细菌抵抗抗生素的能力是悬浮态的10～1000倍［10］，而粪肠球菌在根管牙本质表面形成钙化生物膜的能力正是根管治疗术后仍会出现持续性感染的主要因素之一［11］。因此用抗菌剂来检测悬浮态生长的细菌可能不会反应体内的真实情况，另外细菌生物膜形成能力和其组织结构与底物也有很大关系。目前很多学者在研究细菌生物膜时经常会选择聚苯乙烯和玻璃表面作为底物，但这并不是根管内细菌的天然底物，近来有研究报道用0.0625 g/L次氯酸钠液处理1 min可以根除生长于Calgary装置表面的粪肠球菌生物膜，但是这种浓度次氯酸钠液对根管内壁的生物膜可能无明显效果［12］。

本研究对悬浮生长的细菌检测中，把MTAD按1.5∶400稀释仍具有抗菌性;次氯酸钠液稀释至5 g/L浓度时仍有抗菌效果，而中药浓度则相对需要高一些，为6 mg/mL，这可能是因为在体外检测时，细菌团聚或呈现在生物膜内，大量的细菌处于非活跃状态，杀菌剂不易渗透入整个生物膜中，因此需要加大茶多酚浓度以使更多的药物进入到生物膜内。

另外本研究选择DMSO作为茶多酚的溶剂是因为DMSO是一种清洁、安全、具有高度极性、非质子性溶剂，而中药成分比较复杂，DMSO溶剂可以保证中药中各种成分均可发挥作用［13］。除了MTAD和52.5 g/L次氯酸钠，茶多酚处理3周或6周粪肠球菌生物膜，也显示出了很好的抗菌效果。茶多酚和MTAD处理后，粪肠球菌生存率均显示了8个log值的下降，表明这两种抗菌剂均对粪肠球菌起着非常好的抑制作用。

四环素类药物由于广泛使用已经导致很多细菌对四环素类的药物具有一定的耐药性，因此粪肠球菌可能对MTAD中的多西霉素具有一定耐药性。目前有研究报导MTAD对口腔中分离出的粪肠球菌生物膜具有较小的抗菌性，且不易穿透入生物膜内［8］。52.5 g/L次氯酸钠液在所有实验组中被证明是最有效的，对3周和6周的生物膜均显示出良好的抗菌性，但次氯酸钠是一种强的，非特异性的腐蚀剂，其作用不仅限于坏死组织，对牙本质还具有损伤作用，包括弹性模量和饶曲度降低［14－16］。而茶多酚相对安全，且具有抗氧化、抗炎和清除代谢物等多种功效，相比较传统的根管冲洗剂可能具有一定的优势［17］。

总之，次氯酸钠虽然具有很强的抑制根管内粪肠球菌生物膜的作用，但其一些毒副作用也不容忽视。中药因为一些优良的特性，在根管冲洗方面可能具有一定的优势，但是仍需要更多的研究来证明是否可以作为临床上有效的根管冲洗液。

［1］Siqueira JF Jr，Rocas IN，Lopes HP.Patterns of microbial colonization in primary root canal infections［J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2002，93(2):174–178.

［2］Peters LB，Wesselink PR，Buijs JF，et al.Viable bacteria in root dentinal tubules of teeth with apical periodontitis［J］.J Endod，2001，27(2):76–81.

［3］Stuart CH，Schwartz SA，Beeson TJ，et al.Enterococcus faecalis:its role in root canal treatment failure and current concepts in retreatment［J］.J Endod，2006，32(2):93–98.

［4］Rince A，Le Breton Y，Verneuil N，et al.Physiological and molecular aspects of bile salt response in Enterococcus faecalis［J］.Int J Food Microbiol，2003，88(2 －3):207–213.

［5］Richards D，Davies JK，Figdor D.Starvation survival and recovery in serum of Candida albicans compared with Enterococcus faecalis［J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2010，110(1):125–130.

［6］Gomes BPFA，Lilley JD，Drucker DB.Variations in the susceptibilities of components of the endodontic microflora to biomechanical procedures［J］.Int Endod J，1996，29(4):235–241.

［7］Torabinejad M，Cho Y，Khademi AA，et al.The effect of various concentrations of sodium hypochlorite on the ability of MTAD to remove the smear layer［J］.J Endod，2003，29(4):233–239.

［8］Dunavant TR，Regan JD，Glickman GN，et al.Comparative evaluation of endodontic irrigants against E.faecalis biofilm［J］.J Endod ，2006，32(6):527–531.

［9］Tong Z，Dong L，Zhou L，et al.Nisin inhibits dental caries－ associated microorganism in vitro［J］.Peptides，2010，31(11):2003–2008.

［10］Smith AW.Biofilms and antibiotic therapy:is there a role for combating bacterial resistance by the use of novel drug delivery systems? ［J］.Adv Drug Deliv Rev，2005，57(10):1539－1550.

［11］Kishen A，George S，Kumar R.Enterococcus faecalis－mediated biomineralized biofilm formation on root canal dentine in vitro［J］.J Biomed Mater Res A，2006，77(2):406–415.

［12］Arias－Moliz MT，Ferrer－Luque CM，Espigares－Garcia M，et al.Enterococcus faecalis biofilms eradication by root canal irrigants［J］.J Endod，2009，35(5):711–714.

［13］de la Torre JC.Biological actions and medical applications of dimethyl sulfoxide［J］.Ann NY Acad Sci，1983，411:1–403.

［14］Seltzer S，Farber PA.Microbiologic factors in endodontology［J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol，1994，78(5):634–645.

［15］Sim TP，Knowles JC，Ng YL，et al.Effect of sodium hypochlorite on mechanical properties of dentine and tooth surface strain［J］.Int Endod J，2001，34(2):120–132.

［16］Grigoratos D，Knowles J，Ng YL，et al.Effect of exposing dentine to sodium hypochlorite and calcium hydroxide on its flexural strength and elastic modulus［J］.Int Endod J，2001，34(2):113–119.

［17］Vani T，Rajani M，Sarkar S，et al.Antioxidant properties of the ayurvedic formulation triphala and its constituents［J］.Int J Pharmacogn，1997，35(5):313–317.