升麻提取物纯化工艺研究

靳 波， 刘友平* ， 陈鸿平， 彭 月， 赵祎姗

(1.成都中医药大学药学院，四川成都611137;2.中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137)

升麻为毛茛科植物大三叶升麻Cimicifuga heracleifolia Kom.、兴安升麻C.Dahurica(Turcz.)Maxim.或升麻C.foetida L.的干燥根茎［1］，始载于《神农本草经》，列为上品。升麻中主要有效成分为酚酸类［2］及三萜皂苷类［3］。现代药理试验研究表明升麻提取物中的酚酸类化合物具有抗炎、镇痛、解热及抗血小板聚集等作用［4］，三萜皂苷类化合物具有抗过敏、抗骨质疏松、保肝、抗病毒、缓解妇女更年期综合症等作用［5-6］。植物提取物由于其天然优势，世界植物市场对其需求非常大，目前已经成为拉动中药商品出口的主动力［7-9］。本试验以总酚酸(阿魏酸、异阿魏酸和咖啡酸质量分数之和计，HPLC法)和总三萜皂苷(以升麻苷H-1计，UV法)按权重系数1∶1为评价指标，对升麻提取物纯化工艺进行系统研究，为升麻提取物国家标准和行业标准的制定提供参考。

1 材料

Agilent Technologies 1200 Series高效液相色谱仪(Agilent chemstation工作站，DAD检测器，美国安捷伦公司);UV-1100紫外可见分光光度计;BS200S型万分之一、BP211D型十万分之一电子天平;SHA-C恒温水浴振荡器。阿魏酸(批号110773-200611)、异阿魏酸(批号111698-200602)和咖啡酸(批号110885-200102)对照品由中国药品生物制品检定所提供;升麻苷 H-1为自制，纯度 ＞98%［10］。

2 实验内容

2.1 总酚酸测定 采用HPLC法，以升麻中阿魏酸、异阿魏酸和咖啡酸的质量分数之和计。采用Hypersil BDS C18(200 mm ×4.6 mm，5 μm)色谱柱，乙腈 -0.1% 磷酸水(15 ∶85)为流动相，测定波长为316 nm，体积流量为1.0 mL/min，柱温为30℃。

2.2 总三萜皂苷测定 采用比色法，以升麻苷H-1为对照品，测定升麻提取物中总三萜皂苷。以5%香草醛-高氯酸(1∶4)为显色体系，于60℃水浴中加热15 min，置冰水中冷却2 ～3 min，于537 nm 处测定吸光度［11］。

2.3 纯化工艺研究

2.3.1 树脂预处理 树脂使用前一般需预处理，采用95%乙醇浸泡至充分溶胀。

2.3.2 沉降密度测定 取烘干树脂，称质量w(g)，装柱，用95%乙醇洗脱，当流出乙醇液与蒸馏水(1∶3)混合不呈白色混浊时，用蒸馏水洗至没有乙醇味，测定树脂体积V，用公式ρ=W·V-1，结果见表1。

表1 各型树脂的沉降密度

2.3.3 上柱液制备 将最佳工艺条件［12］提取的升麻提取液回收乙醇至无醇味，加水稀释，离心，取上清液。

2.3.4 树脂性能选择 取质量相同的各型树脂置具塞锥形瓶中，分别加入120 mL上柱液，振摇，吸附完全后，滤过，尽量避免树脂的损失;将过滤完全的树脂转移至锥形瓶中，加入过量的95%的乙醇，计算吸附率和解吸率，结果见表2。

表2 总酚酸和总皂苷的吸附率和解吸率

由表2可知，AB-8和LSA-20大孔吸附树脂解吸效果相近，但AB-8较LSA-20吸附量大，尤其对酚酸类成分，且常用，易于购买，价格相对低廉，结合工业生产情况，故选择AB-8型大孔吸附树脂纯化升麻提取物。

2.3.5 上柱药液浓度考察 在保证所上药材质量相同的条件下，取上柱药液，配置成不同质量浓度，通过装有4gAB-8树脂的吸附柱中，为保证吸附完全，体积流量应控制在2～3 mL/min，测定流出液中指标成分的质量分数，计算比吸附量，结果见表3。

表3 上样液质量浓度考察

结果表明，上柱药液生药质量浓度为0.14 g/mL吸附效果最好。

2.3.6比上柱量考察 将最佳质量浓度的药液120 mL通过装有约2g的AB-8型树脂柱，分段收集流出液，每份10 mL，测定流出液中总酚酸量和总皂苷量，绘制动态泄漏曲线，计算泄漏百分率。结果见表4和见图1。

由泄露曲线表和图1可以看出，上样至第8份时总酚酸和总皂苷累积泄露百分率均超过5%，故比上柱量为4.9 g/g。

2.3.7 洗脱溶媒选择 依照上述工艺条件，量取生药0.14 g/mL上柱液100 mL，通过AB-8型大孔吸附树脂，依次用蒸馏水和不同含乙醇量(10%、20%、30%、40%、50%、70%、95%)各4BV洗脱，测定洗脱液中总酚酸量、总皂苷量及固形物量，计算洗脱率和综合评分。结果见表5。

从洗脱率、固形物量综合评价，选择40%乙醇为洗脱剂。

2.3.8 溶媒用量选择 量取最佳浓度的上柱液90 mL，通过树脂柱，依次用蒸馏水4BV、40%乙醇5BV洗脱，为保证吸附完全，体积流量为2～3 mL/min，同时以1BV/份收集流份。测定各流份中总酚酸和含总皂苷量及固形物量，计算洗脱率。结果见表6。

从固形物的得率，有效成分的保留率和解吸率确定最终工艺为:蒸馏水2BV，40%乙醇5BV，收集40%乙醇洗脱部位。

表4 最大上样量考察

图1 泄漏曲线

2.3.9 工艺验证 量取生药质量浓度为0.14 g/mL的上样药液300 mL，按上述确定工艺依法上柱，平行3份，分别用蒸馏水2BV、40%乙醇5BV洗脱。测定40%乙醇部位各流份中总酚酸量、总皂苷量和固形物量，计算洗脱率及精制度。结果见表7。

表5 洗脱溶媒的考察

表6 洗脱溶媒用量考察

表7 工艺参数验证性试验

结果表明:升麻总提物经大孔树脂纯化后有效地降低了固形物的量，提高了总酚酸和总皂苷的量，总酚酸和总皂苷量的平均精制度分别达426.00%和400.12%，RSD分别为1.50%和 1.37%，该工艺稳定、可行。

3 结果与讨论

3.1 试验首次以升麻中两大活性成分——酚酸类和三萜皂苷类为指标，对升麻提取物的纯化工艺进行研究，达到了较好的纯化效果，且工艺稳定、可行。

3.2 由于咖啡酸的极性较大，在蒸馏水洗去水溶性杂质时容易被洗脱下来，故实验过程中蒸馏水最佳用量为2BV。

3.3 试验有待于对纯化的提取物中大孔树脂的残留和药效学做进一步的研究。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:68.

［2］赵晓宏，陈迪华，斯建勇，等.中药升麻酚酸类化学成分研究［J］.药学学报，2002，37(7):535-538.

［3］鞠建华，杨峻山.升麻族植物三萜苷的研究进展［J］.中国中药杂志，1999，24(9):517-521.

［4］刘 勇，陈迪华，陈雪松.升麻属植物的化学、药理学与临床研究［J］.国外医药·植物药分册，2001，16(2):55-58.

［5］周 亮，杨俊山.升麻族植物中的三萜皂苷及其药理作用［J］.国外医药·植物志分册，2005，20(4):149-156.

［6］高璟春，张金超，朱国元，等.升麻族植物药理活性研究进展［J］.中草药，2006，37(10):3-6.

［7］彭 腾，李柏群，邱明丰，等.植物提取物在我国的应用现状及发展策略［J］.中国药业，2004，13(2):35.

［8］张中朋，刘张林.植物提取物出口实现历史性跨越［N］.医药经济报，2006:8-18.

［9］侯团章.中草药提取物:第一卷［M］.北京:中国医药科技出版社，2004.

［10］靳 波，刘友平，陈鸿平，等.RP-HPLC法测定升麻药材中升麻苷 H-1 含量［J］.四川中医，2011，29(3):66-67.

［11］靳 波，刘友平，陈鸿平，等.比色法测定升麻药材总皂苷［J］.四川中医，2010，28(8):50-52.

［12］靳 波，刘友平，彭 月，等.多指标正交试验优化升麻提取工艺［J］.中国实验方剂学，2011，17(6):27-29.