细胞凋亡小分子PET显像剂的研究进展

黄婷婷，王红亮，唐刚华

（中山大学附属第一医院 核医学PET－CT中心，广东 广州 510080）

细胞凋亡（apoptosis）是细胞生命的基本特征之一。对活体内细胞凋亡进行分子显像对于疾病治疗效果评估、治疗进程的监测、以及某些疾病的早期诊断或研究新疗法具有非常重要意义。正电子发射断层显像（PET）作为近年来新兴的无创性功能性显像手段，是最前沿、最先进的分子影像学技术，研发细胞凋亡PET探针是实现活体内细胞凋亡PET显像的前提条件。临床上细胞凋亡显像剂研究最初主要集中于大分子蛋白质探针，鉴于大分子蛋白质探针的局限性，研发细胞凋亡小分子PET探针具有非常重要的临床价值。

1 细胞凋亡与PET分子显像

1.1 细胞凋亡

最早在1972年，Kerr、Wyllie和 Currie等［1］3位科学家共同提出了“细胞凋亡（Apoptosis）”的概念。细胞凋亡和细胞坏死是细胞死亡的两个主要形式，两者的不同主要在于细胞形态学特征的变化，前者的典型形态学变化表现为凋亡早期细胞体缩小、胞浆量减少、核染色质浓缩、核仁裂解，继之细胞膜内陷，胞体自行分割成许多由膜包裹的结构完整的超微细胞体（称为凋亡小体，Apoptotic Body），最后凋亡小体被邻近组织识别、吞噬或自行脱落，离开生物体，这是一种主动的、程序化的细胞死亡过程。而细胞坏死的细胞结构全面溶解、破坏，是无基因调控、不耗能的被动的细胞死亡过程。

细胞凋亡是多种基因调控的细胞程序化死亡过程，具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制，可见于胚胎发育、组织发生、组织分化、免疫调节等诸多生理过程和恶性肿瘤、心肌梗塞、自身免疫性疾病、病毒感染性疾病、艾滋病等多种病理情况［2］。细胞凋亡是有核细胞固有的生理过程，并受遗传调控蛋白系统的严格制衡，无论生理性的或与疾病相关的细胞变化都可能触发凋亡程序，最终导致细胞进入死亡过程。细胞凋亡的发生主要经过两种途径［3］：①内源性途径，即线粒体途径，线粒体通透性的改变，细胞膜不可逆性的去极化，细胞色素C的释放，蛋白凋亡酶Caspase的激活；②外源性途径，即死亡受体途径，死亡受体及配体（如肿瘤坏死因子、介导凋亡配体相关的肿瘤坏死因子和Fas配体等）的跨膜和诱发Caspase激活信号的传导。细胞凋亡程序通过内源或外源性途径启动之后，凋亡细胞自身会产生一系列的病理生理改变。在这一过程中凋亡细胞将产生（或暴露、结合）多种可识别的、特异性的化学信号（靶标），通过正电子核素标记配体与凋亡细胞中特异靶标结合的特性即可进行细胞凋亡PET分子显像。

1.2 细胞凋亡PET显像的优势

目前，已有多种实验室技术（如形态学方法和细胞分子生物学方法等）用于检测细胞凋亡，这些方法属于体外研究方法，对活体器官、组织具有创伤性，且通常只能在某一特定时间点进行研究，不能连续、动态检测和监测细胞凋亡现象在活体内的发生、发展的全过程，同时受到多种因素的影响。利用无创伤性分子影像学技术，如光学成像、磁共振成像（MRI）、核医学成像技术及超声（US）成像等，用荧光素、顺磁性物质、放射性核素及微泡等报告要素标记AnnexinⅤ作为显像剂，检测活体细胞凋亡，是很有前景的分子显像方法。然而，MRI和US由于灵敏度较低，光学成像技术由于穿透力和断层分辨率较低，其应用受到一定程度的限制。单光子发射计算机断层成像（SPECT）由于具有较低分辨率，其应用也受到一定限制。PET技术在肿瘤学、神经精神病学和心脏病学中的应用价值已得到人们认可，并显示出巨大应用前景。与其他分子影像学技术（如SPECT）相比，PET具有高灵敏度和合适的断层分辨率、标记药物半衰期短且不改变原药物的药理活性等显著优点，通过与X线计算机断层（CT）显像同机融合后，PET显像更趋完善，无创伤性的PET显像可望成为活体内检测细胞凋亡的最佳技术。

1.3 细胞凋亡大分子PET探针的局限性

AnnexinⅤ是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，能够专一性地结合暴露在细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidyl Serine，PS）。99Tcm标记的磷脂结合蛋白（99Tcm－Annexin Ⅴ）是第一个用于临床的细胞凋亡放射性显像剂，临床研究［4］证实：99Tcm－AnnexinⅤ作为显像剂在心血管疾病如心肌梗塞、粥样硬化斑块中的细胞凋亡检测，多种肿瘤（如头颈部肿瘤）的疗效评价和预后判断等方面具有一定优势。然而，由于AnnexinⅤ相对分子质量较大（3.6×104），导致血液清除较慢，信噪比（SNR）低，早期显像效果不佳，以及制备成本高，结合特异性差和具有免疫原性等缺点［5］，阻碍了其在临床上的广泛应用。另外，正电 子 核 素 标 记 的 Annexin Ⅴ （18F－AnnexinⅤ）虽可改善其某些药代动力学特性，但仍不能克服其大分子蛋白质的缺陷，且其放射性标记较复杂，在临床上的应用并不理想［6，7］。其他半衰期较长的正电子核素（如64Cu［8］、124I［9］等）标记的AnnexinⅤ也有报道，但仍处于实验研究阶段，尚无临床研究报道。

2 细胞凋亡小分子PET探针及其应用

理论上，与大分子蛋白质相比，相对分子质量小的化合物作为PET显像剂更有优势［10］，主要表现在小分子PET探针放射性核素标记相对简单易行，而且具有更合适的体内生物分布和清除率，不易引起免疫反应，同时可以通过结构修饰得到应用性能更优化的PET分子探针。细胞凋亡过程中除了外翻PS作为AnnexinⅤ的作用靶点之外，其他的形态学变化或生物学变化都可以作为研究细胞凋亡的重要标志，例如活化的Caspase酶、线粒体膜电位耗散和细胞膜印迹等，并提供了更多可用于检测细胞凋亡的作用靶点。目前研究比较多的细胞凋亡小分子PET显像剂主要有：Caspase酶小分子抑制剂类探针、Aposense分子类探针、靶向线粒体膜电位下降的阳离子类探针［11］以及靶向PS小分子类探针，其各自的代表结构式示于图1。

图1 细胞凋亡小分子PET显像剂的相关结构式

2.1 靶向Caspase PET显像剂

细胞在实现凋亡的两种途径中最后都导致Caspase－3的活化，进而激活内切核酸酶，使DNA链断裂，最终导致细胞结构的全面解体。因此，激活的Caspase酶可作为检测细胞凋亡的一个重要靶点。研究初期主要集中在寻求基于多肽类的配体，后来发现靛红磺胺基类的小分子化合物是一类有效的Caspase抑制剂。通过使用核素标记的Caspase小分子抑制剂靶向结合Caspase，活体内对凋亡细胞进行PET显像，包括化 合 物18F－ICMT－11、18F－WC－Ⅱ－89、11C－WC－98 和18F－WC－Ⅳ－3［12－17］。 这 些 分 子 探 针 与Caspase－3具有较高的亲和力，动物实验表明，在环己酰亚胺或抗Fas抗体介导的肝细胞凋亡模型中肝部放射性摄取明显增高，经过组织学检查也进一步证实了肝细胞发生了凋亡。但是体内外的抑制性实验［17］表明，在加入靛红类化合物作为抑制剂后，放射性摄取未明显降低，同时其生物分布特性较差，这些可能与靛红类化合物的分子结构中含有联二羰基的结构有关。尽管该结构是与Caspase中半胱氨酸的亲核性巯基结合的必需基团，但是该结构也使其易与其他含有胺基和巯基基团的化合物结合，从而导致了该类化合物与其他半胱氨酸蛋白酶（如组织蛋白酶）物质的非特异结合。鉴于Caspases在细胞凋亡过程中的重要作用，用靶向结合激活的Caspase检测细胞凋亡是一种很有效方法，通过进一步优化其分子结构和改善其应用特性，很有可能进入到临床研究。

2.2 线粒体膜去电势化的PET显像剂

近来研究表明，细胞凋亡发生的关键环节不在细胞核，而在细胞质。在凋亡细胞被诱导产生特征性形态改变和DNA降解之前，线粒体膜功能发生改变，内膜跨膜电位消失和线粒体内蛋白酶活化物的释放，激发了各种与凋亡相关的代谢变化。因此，在细胞凋亡初期，细胞内线粒体膜电位下降是细胞凋亡发生的重要标志之一［18］。凋亡因子一旦从线粒体基质传至细胞质后，细胞膜通透性增加，从而导致线粒体膜电位下降［19］。18F－氟苯三苯基磷阳离子（18F－FBnTP）是一种对电位敏感的阳离子PET探针，能够感应到凋亡细胞内线粒体膜电位下降。在正常细胞内线粒体膜内的电化学质子梯度能够促进该阳离子探针进入线粒体基质，而在细胞凋亡早期，该质子梯度消失，使得进入线粒体内的阳离子探针的量减少，造成摄取信号降低。在体外用星孢菌素处理过的肺癌细胞［20］、紫杉醇处理过的乳腺癌细胞［21］和在体内用多烯紫杉醇处理过的荷前列腺癌［22］小鼠模型实验均证实，癌细胞摄取18F－FBnTP明显减低。通过检测线粒体膜电位势能耗损的方法研究细胞凋亡具有一定的局限性。这是由于该方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化，例如细胞内耐药性蛋白质作用也会造成这类阳离子探针的外流，会使一些正常细胞误判为凋亡细胞［20，21］，因而需要进一步优化该类分子探针的性能。

2.3 靶向凋亡细胞膜印迹的PET显像剂

凋亡细胞膜印迹是指发生于凋亡早期细胞的复杂改变。这种印迹包含了质膜势能不可逆缺失、外质膜小叶和细胞液的永久酸化、以及细胞膜磷脂化爬行酶系统的活化，然而细胞膜完整性得以保存。针对此生物性能，研究人员已成功合成了一系列新颖的小分子探针Aposense化合物（如DDC、ML－10、ML－9、NST－732和 NST－729），用于探测与细胞凋亡相关的各种细胞变化，包括凋亡爬行酶的活化、细胞膜不可逆去极化和细胞内液的酸化等［23］。这些化合物已用于抗癌物质介 导凋亡的肿瘤模型［23－25］、肾衰 模型［26］和缺血性大脑卒中的神经血管凋亡［5］等显像。Zeng等［27］通过使用18F 标记的 Aposense化合物NST－732，进一步证实了该类化合物能够用于检测化疗诱导的细胞凋亡。可区分凋亡和坏死细胞的18F标记烷基丙二酸衍生物（18FML－10）是Aposense家族中一种结构简单的化合物（相对分子质量为206）［22］，可在凋亡细胞内选择性浓聚，这与凋亡细胞中线粒体膜势能的消失、Caspase激活、以及凋亡DNA片段化相关。Reshef等［28］利用18F－ML－10在脑中风的活体模型进行PET显像，PET显像清楚显示了在缺血的脑半球摄取明显增加，在对侧则相反。18FML－10的生物分布显示：示踪剂集中在梗塞区域；感兴趣区分析显示，缺血区放射性浓聚程度是对侧的6～10倍，而且18F－ML－10摄取与组织病理学具有很好的相关性。18F－ML－10是首个进入临床阶段探测细胞凋亡的PET小分子示踪剂，目前在数个小规模的临床试验中都表现出较好的应用效果。在临床Ⅰ期试验［29］中，在健康志愿者体内18F－ML－10表现了的高稳定性、适宜的生物分布和剂量浓度。

2.4 靶向PS小分子PET显像剂

细胞凋亡早期，由于细胞内Ca2＋水平增加，使处于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸翻转至细胞外侧，外翻的PS是研究细胞凋亡重要的靶点之一［23，30］。目前一些靶向PS的小分子化合物逐渐被开发，其中最有应用前景的是二（2，2’－二吡啶甲基胺）－Zn2＋类配合物（bis（Zn2＋－2，2｀－dipicolylamine），Zn2＋－DPA），它属于依赖 Zn2＋型小分 子 化 合 物［31，32］。 含 有 报 告 要 素 荧 光 素 的Zn2＋－DPA配位物已用于体外细胞凋亡实验和体内 动 物 肿 瘤 的 光 学 显 像 研 究［33，34］。Tang等［35］通过 N－烷基化反应，引入正电子核素18F标记的氟乙基，实现了Zn2＋－DPA配位物的放射性标记。另外，通过使用18F－SFB得到放化收率更高的18F标记的Zn2＋－DPA配位物，初步的动物实验［35］表明：该类化合物较AnnexinⅤ具有更好的药代动力学特征，荷瘤小鼠经过药物治疗后，18F－FB－DPAZn2＋在肿瘤部位放射性摄取明显增加，且药物治疗前后，18F－FDG在肿瘤部位的放射性摄取没有明显变化。因此，正电子核素标记的Zn2＋－DPA类化合物，对于活体内显像细胞凋亡和肿瘤药物的疗效评价具有一定的应用潜力。

3 结语与展望

综上所述，从靶向PS的AnnexinⅤ为代表的蛋白类大分子探针，到探测细胞凋亡过程中多个级联反应中的小分子探针，说明研发新的细胞凋亡小分子PET显像剂将是细胞凋亡分子显像领域重要的发展方向。小分子PET探针今后几年的发展方向主要体现在以下几个方面。

1）靶向PS的小分子PET探针是研究的热点之一，具有很大发展潜力，目前靶向PS的小分子PET探针除本研究团队的报道外，尚未发现其他研究报道，靶向PS的小分子PET探针是细胞凋亡小分子PET显像的重要发展方向。

2）能区分细胞凋亡和坏死的小分子PET显像剂的研制，也是细胞凋亡研究的热点领域。尽管目前已有可区分细胞凋亡和坏死的小分子PET显像剂用于临床的研究报道，但其在临床中的实用性有待于进一步研究。

3）针对细胞凋亡过程中表达的其他靶点分子，研制新型细胞凋亡小分子PET显像剂，也是细胞凋亡小分子PET显像的重要发展方向。

此外，对于临床上如何准确评价抗肿瘤药物治疗效果的问题，一直是抗肿瘤治疗研究的热点领域。传统观点认为细胞凋亡显像能够准确评价抗肿瘤治疗效果，但是抗肿瘤治疗在导致细胞凋亡的同时，也伴随着细胞坏死［30］。判断细胞凋亡和细胞死亡能更准确评价肿瘤治疗效果，这是临床上必须解决的难点问题。

总之，开发能最大限度涵盖细胞凋亡途径和非凋亡途径的多个作用靶点的新型小分子细胞凋亡PET显像剂是今后发展的重要方向。

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