新型骨显像剂99Tcm－BIPr DP的制备及其反应动力学研究

张 姝，罗世能，邱 玲，林建国，夏咏梅

（1.江南大学 化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122；2.江苏省原子医学研究所，卫生部核医学重点实验室，江苏省分子核医学重点实验室，江苏 无锡 214063）

自20世纪70年代初用99Tcm标记的亲骨显像剂问世以来，放射性核素骨显像已被广泛应用，并成为核医学科的一个重要分支［1］。目前临床上使用的骨显像剂主要是99Tcm标记的双膦酸盐类，其中以99Tcm－MDP 应用最为广泛［2］，它具有亲骨特异性强、血液清除率快、骨显影清晰、毒性低、不被肝脏摄取等优点，但其在体内代谢较慢，给药后需要3～4h才能显像［3］。

唑来膦酸是分子内含有咪唑基的第3代双膦酸盐类药物的代表，该药主要用于治疗肿瘤引起的高钙血症、骨转移和老年骨质疏松症及预防骨转移患者的并发症，是目前临床试验中作用最强的双膦酸盐化合物［4］。用99Tcm标记唑来膦酸盐类药物进行骨显像，1h后即可得到清晰的骨显 像［5，6］，与99Tcm－MDP 相 比，99Tcm标 记 唑来膦酸盐类药物大大缩短了显像等待时间。然而前期研究表明，该类显像药物虽然有较高的骨摄取，但在肝、脾、肺和肾的吸收均很高，且清除速率较慢，对人体健康不利［2］。近年来，本研究小组报道了用99Tcm标记唑来膦酸衍生物如MIDP［7］、EIDP［8］、PIDP［9］和i－PIDP［5］，并 探 索了其进行骨显像的可能性。结果显示，室温下标记率均可达到90%以上；当咪唑环上的2位上引入烷基取代基时，其显像效果明显提高，肝、脾、肺的吸收明显降低，只有肾的吸收较高，可以说明该药物主要经肾代谢，通过尿液排出体外，对人体其他组织伤害较小。

最近本研究小组制备出了一种新型的唑来膦酸衍生物：1－羟基－3－（2－丁基－1H －咪唑－1基）丙烷－1，1－双膦酸（BIPrDP），它是在唑来膦酸的基础上，对其结构进一步优化，在咪唑环的2位上引入丁基取代基，并将与双膦酸基团相连碳的个数由2增加到了3。用Na99TcmO4对BIPrDP进行标记时，发现该化合物在室温下标记率很低，不能满足要求。为此，本课题组进一步研究了99Tcm－BIPrDP制备反应动力学性质。通过标记反应动力学的研究，旨在揭示反应温度和时间对99Tcm－BIPrDP 制 备 的 影响，为99Tcm－BIPrDP的制备提供理论依据，也为该类99Tcm标唑来膦酸类放射性药物今后在临床上的推广应用提供重要的指导信息。

1 实验材料

1.1 主要试剂

2－丁基咪唑：上海翰鸿化工科技有限公司；溴丙酸乙酯：上海邦成化工有限公司；Na99TcmO4淋洗液：江苏省原子医学研究所附属江原医院提供；氢氧化钾、碳酸钾、四丁基溴化胺、三氯化磷、磷酸、盐酸、氯化亚锡均为中国医药集团上海试剂公司。

1.2 主要仪器

Yanadimoto型熔点仪：日本岛津公司；WatersPlatform ZMD4000型质谱仪：美国 Waters公司；Bruker AM400型核磁共振仪：Bruker光谱仪器公司；γ计数仪：Perkins Elmer仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 BIPrDP的合成

在参阅文献［10－12］的基础上，对唑来膦酸进行结构改进，自行设计合成BIPrDP，具体合成线路示于图1。采用 MS、1H－NMR和元素分析方法对目标物和中间体进行结构鉴定。

2.1.1 3－（2－丁基－1H－咪唑－1－基）丙酸乙酯（b）的合成 向250mL三口烧瓶中加入12.4g（0.1mol）2－丁基 咪 唑 （a）、13.8g（0.1mol）K2CO3、8.4g（0.15mol）KOH、0.8g（0.002 5mol）四 丁 基 溴 化 铵 和 100mL CH2Cl2，室温下搅拌0.5h。用恒压漏斗向烧瓶中缓慢滴加12.7mL（0.1mol）溴丙酸乙酯，在50℃油浴下反应20h。过滤，滤饼用50mL CH2Cl2洗涤3次。滤液再用饱和NaCl溶液洗3次，取CH2Cl2层，减压浓缩，除去CH2Cl2，得到红褐色黏稠液体b，此物质未经进一步纯化，直接用于下一步反应。

2.1.2 3－（2－丁基－1H－咪唑－1－基）丙酸（c）的合成 将上述红褐色黏稠液体b加入250mL烧瓶中，再加入100mL H2O和固体NaOH调反应液pH为13～14，加热至110℃，反应7h。待反应充分后加入2g活性炭脱色30min，趁热抽滤得棕褐色水溶液，加浓盐酸调其pH为1～2，减压蒸去溶剂，有大量白色固体析出。在白色固体中加乙醇，过滤将白色物质除去，再将滤液减压旋蒸，得深黄色黏稠状液体。将液体倒入研钵，加少许石油醚研磨，有浅黄色固体出现，干燥后用异丙醇重结晶，真空干燥得白色晶体c。

2.1.3 1－羟基－3－（2－丁基－1H－咪唑－1－基）丙烷－1，1－双膦酸（BIPrDP）的合成 于100mL三颈烧瓶中加入3.92g（0.02mol）c、5.0mL质量分数为85%H3PO4和15mL氯苯，混匀后加热至110℃，搅拌1h后降温至65℃，缓慢滴加7.8mL三氯化磷，约30min滴加完毕，升温到120℃，反应8～10h，至下层呈粘稠状搅不动时，停止反应。反应液冷却至室温，倒去上层氯苯，在100℃下加入30mL 9mol／L的 HCl水解7h。反应结束后，过滤，除去黄色杂质，滤液呈黄色，用2～3g活性炭脱色，在100℃下脱色30min。过滤除去活性炭，得到浅黄色澄清透明的液体。将滤液旋转蒸发，得到少许浅黄色油状物，待冷却后，向冷的乙醇中倒入反应液，有白色固体析出，搅拌4h后抽滤，得白色固体，干燥后用水重结晶，真空干燥得白色固体d。

2.2 99Tcm－BIPrDP的制备

99Tcm－BIPrDP 的 合 成 过 程 示 于 图 2。 取250mg BIPrDP，用1mL 0.1mol／L的 NaOH溶液溶解，加水稀释至5mL，配成50g／L的BIPrDP钠盐溶液，pH 约为6；将10mg SnCl2·2H2O溶于10mL的0.5mol／L的盐酸中，配成1g／L SnCl2·2H2O溶液。

图1 BIPrDP的合成路线

图2 99Tcm－BIPrDP的合成

分别在40、50、60、70、80和90 ℃下，在10mL西林瓶中加入100μL BIPrDP钠盐溶液、100μL新鲜配制的SnCl2的盐酸溶液、1.8mL pH为6的磷酸盐缓冲溶液（PBS）和新鲜淋洗的Na99TcmO4溶液（37.0MBq）。

2.3 标记率的测定

采用TLC法，以新华一号层析纸为支持物，双体系为展开剂，体系1为丙酮，体系2为水，展开后用γ计数仪测量各部分计数，进而计算出标记率。

99Tcm－BIPrDP在丙酮中Rf＝0～0.1，在水中Rf＝0.8～1.0，99TcmO2在丙酮和水中的Rf＝0～0.1，游离99TcmO4－在丙酮和水中的Rf＝0.9～1.0。

2.4 反应速率常数

99Tcm与 BIPrDP的反应如下式［13－16］所示：

假设反应为二级反应，则99Tcm（BIPrDP）2（OH）2的生成反应速率可以表示为：

其中，a＝ ［99Tcm］0；b＝ ［BIPrDP］0；x＝［99Tcm（BIPrDP）2（OH）2］；k为反应速率常数；t为反应时间。

对（1）式积分得，

因为b ≈ 10－2～10－3mol／L，a ≈ x ≈10－8～10－9mol／L，即b≫a≈x，b－2x ≈b，b－2a≈b。因此（2）式可简化为：

x／a为标记率RLY，它可通过放射性测量得到，故可将（3）式改写为

2.5 反应活化能

反应活化能与反应速率常数和反应温度均有关系，这种关系可用阿伦尼乌斯（Arrhenias）方程表示［13］：

将（5）式两边取对数得

其中，Ea为反应活化能；A为频率因子；T为绝对温度；R 为气体常数（8.314J·mol－1·K－1）。

3 结果与讨论

3.1 BIPrDP的表征

共经过三步反应，得到白色固体，总产率为23.6% 。mp：148～150 ℃。ESI－MS（m／z）：343（M＋）。1H NMR（400MHz，D2O）：δ7.35（d，1H，CH－ring），δ7.23（d，1H，CH－ring），δ4.36～4.40（t，2H，NCH2），δ2.92～2.95（t，2H，CH2CH2CH2CH3），δ2.32～2.43（m，2H，NCH2CH2，JC－P＝13.79Hz），δ1.64～1.71（m，2H，CH2CH2CH3），δ1.27～1.35（m，2H，CH2CH3），δ0.83～0.86（t，3H，CH2CH3）。C10H20N2O7P2元素分析值 （计算值）／%：C，35.06（35.10）%；H，5.92（5.89）%；N，8.17（8.19）%。以上数据说明合成的产物为设计合成的化合物BIPrDP。

3.2 标记率与反应时间的关系

不同温度下标记率与反应时间的关系示于图3。由图3可以看出，反应温度对99Tcm－BIPrDP的标记率影响很大。在40℃时，反应达到平衡时标记率仅为约50%；在60℃时，达到75%左右；只有当温度升高到90℃时，反应平衡时的标记率才能明显超过90%。另外，由图3也可以看出，虽然在不同的温度下，99Tcm－BIPrDP的最大标记率有很大的不同，但它们所达到平衡的时间却比较相近，均是在几十秒内完成。这种关系，可以依据物理化学中的化学反应动力学和化学反应热力学知识加以进一步研究。

3.3 反应速率常数的计算

由反应速率常数推导出的（4）式表明，以ln（1－RLY）－1对t作图应得一直线，直线斜率为K，结果示于图4。对图4进行线性拟合，可知，在6个不同温度下，ln（1－RLY）－1与t都呈良好的线性关系。40 ℃时，ln（1－RLY）－1＝0.018 3t＋0.329，r2＝0.980 4；50 ℃时，ln（1－RLY）－1＝0.020 7t＋0.723，r2＝0.996 1；60 ℃时，ln（1－RLY）－1＝0.024 1t＋0.872，r2＝0.990 5；70℃时，ln（1－RLY）－1＝0.027 0t＋1.041，r2＝0.993 7；80 ℃时，ln（1－RLY）－1＝0.028 8t＋1.814，r2＝0.986 7；90 ℃时，ln（1－RLY）－1＝0.031 9t＋2.261，r2＝0.999 3。

图3 标记率（RLY）与反应时间的关系

各温度下直线的斜率即为该温度下的反应速率常数，即在40、50、60、70、80和90℃下的反应速率常数k分别为0.018 3、0.020 7、0.024 1、0.027 0、0.028 8和0.031 9。

图4 ln（1－RLY）－1和反应时间（t）的关系图

将温度从40℃升高到60℃，反应速率常数k增大了约1.32倍；将温度从50℃升高到70℃、60℃升高到80℃和70℃升高到90℃时，反应速率常数k分别增大了约1.30倍、1.20倍和1.18倍。这表明在低温下升高反应温度比在高温下升高反应温度对反应速率的影响要大一些。

99Tcm－BIPrDP的制备反应是一个较为复杂的反应，包含着还原反应和配合反应。首先SnCl2把锝从高价还原到低价，在还原反应中，99TcmO4－的初始浓度为a≈10－8～10－9mol／L，SnCl2的浓度约为10－3～10－4mol／L，SnCl2的用量较99TcmO4－大幅过量，99Tcm却能以极高的标记率稳定住相应标记物的氧化态，该溶液中的99Tcm仅有3%以下被还原分解为99TcmO2等杂质［17］，说明此还原反应发生很快，而且转化率大于97%；之后低价99Tcm再和BIPrDP发生络合反应，BIPrDP的初始浓度为b≈10－2～10－3mol／L，b≫a，符合准一级反应条件，在整个反应过程中BIPrDP的浓度可视为常数，可并入速率常数项，则此反应可称为准一级反应［18］。

3.4 反应活化能的计算

根据（6）式可以看出，以lnk对1／T作图应是一条直线，斜率为－Ea／R，由斜率可以求出反应活化能Ea。lnk与1／T的关系示于图5。图5显示，lnk与1／T之间存在着良好的线型关系，采用最小二乘法进行线性回归，得到lnk与1／T的线性方程为：

由式（7）可以求得反应活化能 Ea：Ea＝－1 267.1×（－8.314）＝10.53kJ·mol－1。

图5 lnk与1／T的关系

与一般反应活化能的典型值20～150kJ·mol－1相比，99Tcm－BIPrDP的制备反应所需的活化能很低，即反应要克服的势能垒较低，反应更易进行［19］。据文献［20］报道，99Tcm－BIDP 的反应活化能为10.45kJ·mol－1。表明此类99Tcm标记唑来膦酸衍生物制备反应的活化能相差不大。计算出本反应的反应活化能数值较小，说明本反应的反应速率很快，也验证了本反应在较短时间内即可达到平衡的事实。

3.5 反应热与平衡标记率的计算

3.3节的研究结果表明，99Tcm－BIPrDP的制备反应为准一级反应，即总反应表现为对99TcmO4－是一级反应［21］。用c 表 示反应初始99TcmO4－浓度，xe表示反应达到平衡时99Tcm－BIPrDP的浓度。由于c约为10－8～10－9mol·L－1，即浓度很低，标记反应涉及的其它常量反应物和生成物的浓度及溶液的离子强度近似不变，标记反应的平衡常数Kθ可表示为99Tcm的分配比乘以一个常数Q，即Kθ＝DQ，令Kp＝Kθ／Q，则Kp＝D。

因此，该反应的平衡常数Kp表示为：

（8）式中，RLY＝xe／c表示平衡时99Tcm－BIPrDP的标记率，即在一定温度下99Tcm－BIPrDP的最大标记率。

根据吉布斯－亥姆霍兹公式推得平衡常数Kp与反应热△H的关系为：

式中，C为常数；R 为气体常数（8.314J·mol－1·K－1）。在反应温度变化不大的情况下，△H 可看成常数。将（8）式代入（9）式，得到99Tcm－BIPrDP的平衡标记率（RLY）与反应温度的关系为：

由（10）式可以看出，ln［RLY／（1－RLY）］与1／T 存在着良好的线性关系，将40、50、60、70、80和90℃下达到平衡的ln［RLY／（1－RLY）］对1／T 作图，可得，△H＝51.71kJ·mol－1，C＝19.84，故ln［RLY／（1－RLY）］＝－6 218.4／T＋19.84。将 RLY＝90%代入可得T＝352.46K，即T＝79.31℃。

当标记率达到90%时，最低反应温度是79.31℃。说明满足标记要求的最低反应温度阈值是79.31℃。

4 小 结

99Tcm－BIPrDP的制备反应为准一级反应。99Tcm－BIPrDP的制备反应受温度的影响较大，标记率随着温度的升高而逐渐变大。根据放射性药物的临床使用要求，放射性药物的标记率应在90%以上，满足这一要求的最低反应温度阈值为79.31℃，达到平衡的时间仅为20s。与99Tcm－MIBI在100℃条件下3min达到平衡相比，99Tcm－BIPrDP达到平衡所需的时间短，应用更为方便。因此，考虑到临床的需要、操作简单等，只需在沸水浴（100℃）下反应片刻即可完成。

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