慢性牙周炎患者和健康者非刺激性全唾液中的差异蛋白比较

武影 束蓉 刘宏伟

（1.同济大学附属口腔医院 牙周科，上海 200072；2.上海交通大学医学院附属第九人民医院 牙周科，上海 200011）

唾液是人体的一面镜子，许多疾病都可以在唾液中找到相关的蛋白分子标记物，如舍格伦综合征、类风湿病、高血压、糖尿病等。尽管利用唾液检测诊断全身性疾病有较大发展但应用于口腔疾病的研究还很少，而且主要用于口腔癌的早期诊断和预后判断[1]。目前已有涉及牙周病的唾液蛋白组学研究[2-3]。

众所周知，慢性牙周炎是与全身性疾病密切相关的多因素疾病，其发病机制尚不清楚。利用慢性牙周炎患者和健康对照者的非刺激性全唾液（whole unstimulated saliva，WUS），通过蛋白组学方法，即双向凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）结合基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱检测二者唾液中的差异，并对差异蛋白质点进行鉴定，为今后揭示慢性牙周炎的机理奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验对象

根据1999年美国牙周病分类国际研讨会提出的慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）的诊断标准[4]，从上海交通大学医学院附属第九人民医院牙周科就诊的患者中随机选取5例CP患者。同时选取5例健康对照者，牙龈探诊出血的位点＜10%，探诊深度＜3mm，附着丧失＞2mm的位点不超过1%，X线片显示无牙槽骨吸收。各组均有3名男性，2名女性；CP组和对照组平均年龄分别为46、42岁。2组共同纳入标准：全身无系统性疾病；妇女未处于怀孕期及哺乳期；半年内未做过牙周基础治疗；最近3个月未服用过抗生素；全口无龋者；无抽烟者。

1.2 WUS的采集和处理

按照Rhodus改良的方法采集WUS[5]。每人平均采集1.2mL唾液，采集后立即加入蛋白酶抑制剂（Sigma公司，美国，每毫升唾液加入100μL）。将所得样本在4℃条件下离心，先1 300 g，5min，去除食物残屑等；然后20 000 g，30min，彻底去除残余细胞。最后各取其上清500μL，-80℃保存待用。待收集完所有的样本后，合并组内各样品，分别放入超滤管离心以进行样品超浓缩。依照Bradford法，通过测定光密度值大小并对照标准蛋白的光密度值计算蛋白浓度，从而进行蛋白定量[6]。

1.3 2-DE

取上样量100μg，等电聚焦为pH3～10非线性胶条（30V 12 h，500V 1 h，1 000V 1 h，8 000V 8 h；Amersham公司，美国），十二烷基硫酸钠-聚炳烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）为12.5%的胶。经银染显色的凝胶通过GS-710光密度扫描仪获取图像，使用Imagemaster分析软件（GE healthcare公司，美国）进行分析，统计3次重复实验的2-DE图谱（CP组和对照组各3次），得到合乎统计学标准的蛋白质差异点。蛋白质斑点的量被定义为构成这个点所有象素点强度值的总和，当一种蛋白质在2组样品之间量变倍数大于1.5倍时认为这个蛋白在二者之间有显著性差异。

1.4 基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱仪进行肽质量指纹分析

切取胶上的蛋白差异点并用胰酶酶解20 h，抽提酶解肽段，经Zip Tip脱盐后样品溶于0.1%三氟乙酸，然后基质与样品1∶1体积混合，取1μL加到不锈钢样品靶上，在空气中放置10min，待溶剂挥发干后将样品靶送入仪器。利用Flex Analysis分析软件将肽质量指纹分析（peptide mass fingerprinting，PMF）数据和MS-MS数据结合，将结合数据集提交到MASCOT（免费蛋白数据库检索程序）进行蛋白鉴定。搜索NCBInr数据库，搜索的参数：肽片段相对分子质量最大容许误差控制在±10-4，肽电荷为+1，酶解片段不完全选择为1个。根据蛋白质得分与蛋白质数据库查询蛋白质的匹配和序列覆盖情况，其中Mascot得分示意图：X轴为Mascot得分，Y轴为匹配的个数，得分超出阴影区表示得到阳性鉴定（P＜0.05）。

2 结果

通过ImageMaster软件对2组样品2-DE胶上的点进行对比分析，发现2组之间存在着差异点（组间差异倍数≥1.5），得到17个差异点（图1）。

而这些点经过以上串联质谱仪结合数据库搜索进行鉴定，可明确其中的13个点的蛋白质类型，包括一些未命名蛋白和假设蛋白（表1），其中737、725、692、986为同一种蛋白，716、535为相同蛋白。剩下的蛋白未能从数据库中得到结果，提示可能为未知蛋白。这些差异蛋白在CP组的唾液中表达均增加，其中包括血清白蛋白（serum albumin）、β-纤维蛋白（βfibrin）、重组N-叶apo型人血清转铁蛋白2型晶体B链（chain B，human serum transferrin，recombinant N-terminal lobe，Apo form，crystal form 2）、免疫球蛋白α-1链C区（Ig alpha-1 chain C region）、 人血清白蛋白GA复合物（the GA module complexed with human serum albumin，HBA-GA）、Rca-Rhogdi复合物的B链（chain B，crystal structure of a Rca-Rhogdi complexes）、PRO2044、未命名蛋白、理论蛋白。

表1 CP组和对照组间的唾液差异表达蛋白Tab 1 Differentially expressed proteins in saliva between control group and CP group

3 讨论

本实验结果发现血清白蛋白在CP患者WUS中的表达是上调的，这与以往的研究报道患者全唾液中白蛋白含量显著升高的结论一致[7-8]。因为全唾液中含有10%来源的龈沟液成分，在牙周组织炎症状态下龈沟液流量增大，进入唾液的成分也可能增高，其中包括血液中高丰度的白蛋白，同时这些蛋白也可经炎性牙龈组织直接渗出。血清白蛋白在唾液中的升高反映了牙周炎的严重程度和活动性，可作为CP患者唾液中的分子标记物。实验还发现免疫球蛋白与对照组相比，CP患者全唾液中的IgA1上调，原因同上述解释一样，IgA1主要来自血液渗出，而且有研究表明糖尿病患者的IgA是升高的[9-10]。在CP组和对照组的差异蛋白比较中发现HBA-GA复合物，GA是厌氧性消化链球菌属来源的白蛋白结合蛋白分子结构上的一个模块，可以和宿主的血清白蛋白结合，形成HBA-GA复合物，有利于细菌的生长，也可增强细菌的毒力[11-12]。虽然GA的生物学功能还不十分清楚，但从其结构上可以解释细菌适应性这个问题。这也提示牙周致病菌是否也有类似的结构和白蛋白结合，继而引起一系列变化导致组织的破坏。既然HBA-GA复合物关系着致病微生物和宿主血清白蛋白之间的相互作用，研究二者可能会有助于揭示牙周致病菌的分子机制，以及为开发药物以抑制细菌的生长繁殖开辟一个新的领域。与此同时，上调的转铁蛋白和纤维蛋白都与炎性渗出增加有关。而Rca-Rhogdi复合物通过Rhogdi调节Rho蛋白，但在炎症中究竟有什么作用还不甚清楚。

本实验未发现在牙周炎患者唾液中表达升高的防御素以及一些基质金属蛋白酶等，这可能由于采用的实验方法不同以及2-DE技术自身的缺点所致。对于蛋白质表达谱，希望比较2个不同样品在2-DE胶上存在着特征点强度的不同。但很难得到精确的重复性。同时特定蛋白质的位置通常有微小变化。所以只能选择重复性好的点进行鉴定，这样就会损失一些可能有意义的蛋白。而且，由于样品中高丰度蛋白的干扰和低丰度蛋白的低溶解度，造成低丰度蛋白很难被检测到，恰恰这些蛋白是执行重要生物功能的蛋白质。这需在以后研究中进一步探索。

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