高氧环境下肺成纤维细胞RB蛋白磷酸化状态的改变*

赵诗萌 魏 兵 吴红敏 薛辛东

早产儿慢性肺疾病（chronic lung disease，CLD）是早产儿长时间吸入高浓度氧后最常见的并发症，其晚期病理结局是肺间质纤维化，表现为肺成纤维细胞（lung fibrolast，LF）的过度增殖[1]。G1/S是细胞周期的关键性调控点，高氧通过抑制G1/S调控点的作用，促使LF更多地从G1期进入S期，导致LF过度增殖[2]。RB基因是G1/S调控点的核心，有磷酸化及非磷酸化2种形式，其中RB磷酸化的RB蛋白可能参与对细胞增殖的负调控作用。本研究的主要目的是通过检测CLD鼠不同发展阶段LF总RB蛋白及磷酸化RB蛋白的表达,探讨RB基因在CLD鼠肺间质纤维化中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康成年雌性SD大鼠60只，成年雄性SD大鼠15只，清洁级，体质量220～240 g，购自中国医科大学附属盛京医院实验动物部，雌雄交配（4∶1）。将孕22～23 d自然分娩的新生SD大鼠共120只（连同母鼠）随机分为空气对照组和高氧组，每组60只新生鼠及30只母鼠。高氧组于生后12 h内置于玻璃氧箱（60 cm×50 cm×40 cm）中，持续输入氧气，维持吸入气体氧浓度（FiO2）体积分数在0.85，用钠石灰吸收CO2，使其体积分数为0.005。温度22℃～25℃，湿度50%～70%，每天定时开箱30 min，添加水、饲料及更换垫料，并与空气组交换母鼠以免因氧中毒而导致喂养能力下降。空气组置于同一室内空气中（FiO2的体积分数为0.21），饲养条件与高氧组相同。

1.2 实验方法

1.2.1 肺成纤维细胞原代培养 分别于实验后3、7、14、21 d随机处死动物后，无菌条件下采集肺组织，进行LF细胞的原代培养[3]。待细胞铺满瓶底后按1∶2传代，收集第3代细胞用于实验[3]。

1.2.2 免疫组化技术检测总RB及磷酸化RB蛋白表达 取同代细胞接种于盖玻片上，第2天取出盖玻片用4%多聚甲醛固定。按免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）步骤操作，一抗分别为兔RB单克隆抗体（美国NEO⁃MARKERS公司）、羊抗人p-RB丝氨酸（ser）-795多克隆抗体（Santa Cruz公司产品），DAB显色。显微镜下观察并拍片，每组动物各时间点培养的LF免疫组化爬片随机抽取10张，每张片子于光镜（×400）随机取5个视野，蛋白质半定量测定应用美国Universal Imaging Porporation图像分析系统，应用Me⁃ta Morph软件分析阳性细胞的着色强度，以平均积分光密度值表示RB及p-RB产物的强度。

1.3 统计学分析 所有数值均采用SPSS 11.5统计软件分析，数据用±s表示，两样本均数比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺成纤维细胞RB蛋白免疫组化结果 高氧组与空气组相比，各时点RB蛋白的表达差异无统计学意义（P>0.05），见表1、图1。

表1 2组肺成纤维细胞RB免疫组化光密度值比较（n=10±s）

表1 2组肺成纤维细胞RB免疫组化光密度值比较（n=10±s）

均P>0.05

组别空气组高氧组t 3 d 0.256±0.014 0.249±0.021 0.83 7 d 0.250±0.024 0.261±0.022 1.01 14 d 0.257±0.027 0.266±0.033 0.63 21 d 0.256±0.020 0.261±0.037 0.16

2.2 肺成纤维细胞p-RB蛋白免疫组化结果 生后3 d时2组p-RB蛋白的表达差异无统计学意义（P>0.05）,生后7～21 d时高氧组表达开始增多，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），见表2、图2。

表2 2组肺成纤维细胞p-RB光密度值比较（n=10±s）

表2 2组肺成纤维细胞p-RB光密度值比较（n=10±s）

*P<0.05，**P<0.01

组别空气组高氧组t 3 d 0.089±0.002 0.092±0.005 1.67 7 d 0.095±0.006 0.102±0.004 2.91*14 d 0.089±0.005 0.104±0.008 4.77**21 d 0.091±0.006 0.110±0.007 6.19**

3 讨论

真核细胞分裂增殖必须通过2个关键的细胞周期调控点：G1/S和G2/M关卡调控点。目前对G1/S调控点途径研究得较为深入，RB蛋白是该调控点的中心。现已证实，在多种肿瘤中均可见RB蛋白的表达异常[4]，其原因一方面可能与RB蛋白自身变异有关,另一方面也可能是由于细胞周期素依赖激酶的抑制因子,如p16Ink4a的去活化促进RB的磷酸化而失活。

Rb基因主要以分子质量为110 ku的非磷酸化形式和分子质量介于110～116 ku的不同程度的磷酸化形式存在，RB蛋白功能的发挥依赖激酶和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化调节实现的，其以磷酸化和去磷酸化的形式决定着转录因子E2F的活性，在细胞周期调控中处于中心环节，从而控制着细胞的生长和分化[5]。低磷酸化或非磷酸化的RB，可以结合并抑制E2F转录因子，阻止细胞由G1期进入S期，从而抑制细胞增殖。RB蛋白共含有16个细胞周期素依赖性激酶的磷酸化位点,Rb蛋白的功能状态依赖于不同位点的磷酸化，其中ser-795位点磷酸化是从有活性的非磷酸化状态向无活性的磷酸化状态转变的标志。ser-795可以被cyclin D1/CDK4磷酸化，由此解除了RB介导的对细胞周期的抑制[6]。

笔者前期的研究发现，高氧可导致新生鼠肺组织P16基因启动子甲基化异常，使肺成纤维细胞P16基因表达失活[7]。而当P16蛋白低表达或不表达时，cyclin D过表达与CDK4结合，从而使RB蛋白磷酸化而导致其与转录因子E2F1解离，游离状态的E2F1进入核内结合一系列具有特殊序列的基因启动子区，促进这些基因的表达，这些基因产物促进细胞通过G1/S调控点，细胞提前进入S期，细胞生长失控。为了证实这一推论，笔者观察和比较总RB蛋白及磷酸化RB在LF中的表达，结果发现高氧及空气各实验组肺成纤维细胞RB蛋白的表达均无明显差异，说明高氧不能改变总RB蛋白的表达。与空气组相比，生后7 d时高氧组p-RB表达开始增多，提示高氧可能通过抑制P16基因的表达，使得RB蛋白磷酸化，导致RB蛋白功能障碍,解除了RB蛋白对细胞周期的抑制，细胞过度增殖。

[1]Baraldi E,Fillipone M.Chronic lung disease after premature birth[J].N Engl J Med,2007，357(19):1946-1955.

[2]赵诗萌，吴红敏，刘雪雁，等.CLD鼠肺成纤维细胞的原代培养及生物学行为研究[J].中国现代医学杂志,2009,19（17）:2561-2564.

[3]Kelleher MD,Naureckas ET,Solway J,et al.Hershenson.In vivo hy⁃peroxic exposure increase cultured lung fibroblast proliferation and c-Ha-ras expression[J].Am J Respir Cell Mol Biol,1995,12(1):19-26.

[4]Contu SS,Contu PC,Damin DC,et al.pRB expression in esopha⁃gealmucosa of individuals at high risk for squamous cell carcinoma of the esophagus[J].World J Gastroenterol,2007,13(11):1728-1731.

[5]Dasgupta P,Betts V,Rastogi S，et al.Direct binding of apoptosis sig⁃nal-regulating kinase 1 to retinoblastoma protein:novel links be⁃tween apoptotic signaling and cell cycle machinery[J].J Biol Chem,2004,279(37):38762-38769.

[6]Thomas NS,Pizzey AR,Tiwari S,et al.p130,p107,and pRb are dif⁃ferentially regulated in proliferating cells and during cell cycle ar⁃restby alpha-interferon [J].JBiolChem,1998,273(37):23659-23667.

[7]Yue X,Fu J,Xue X,et al.Detection of p16 promoter methylation in premature rats with chronic lung disease induced by hyperoxia[J].Pediatr Int,2010，52(4):520-526.