ABCA1启动子区基因多态性与血脂水平及冠心病的关系

程爱娟 毛用敏 崔让庄 吴尚勤 孙 姗

腺苷三磷酸结合盒转运蛋白A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCAl）是细胞膜上一种重要胆固醇流出调节蛋白（Cholesterol effuse regulatory protein，CERP），其介导的细胞内胆固醇流出是胆固醇逆向转运（Reverse cholesterol transportation，RCT）的起始环节，ABCAl正常表达可提高循环高密度脂蛋白（HDL）水平[1]，因此ABCAl表达水平对维持细胞内外的胆固醇平衡、调节血脂以及防止动脉粥样硬化的发生可能具有重要意义。文献报道，ABCA1基因突变可导致个体HDL胆固醇（HDL-C）严重缺乏而引发冠心病[2]。本研究针对ABCA1基因启动子-14 bp位点基因多态性与冠心病发生及血脂水平的关系进行探讨。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2007年9月—2008年5月我院心脏科住院患者428例，均为长期居住天津市、相互无亲缘关系者。冠心病组228例，其中男122例，女106例，均符合中华医学会心血管病分会提出的冠心病诊断标准。患者均经冠状动脉造影证实主要1支血管狭窄≥50%；对照组200例，其中男113例，女87例，经冠状动脉造影排除冠心病。2组临床资料比较差异无统计学意义，具有可比性，见表1。

1.2 方法 晨起抽取肘正中静脉血5 mL，EDTA抗凝，低渗溶血法提取DNA。聚合酶链反应（PCR）扩增引物：引物参照文献[3]设计，由上海生工生物工程公司合成，引物序列为：上游5′-GAC TGA ACT ACA TAA ACA GAG G-3′，下游5′-CGG CCC CAC TCA CTC TCG-3′。PCR扩增体系及参数：25 μL反应体系中各物质的浓度为60 mmol/L Tris-HCl,pH 9.0，15 mmol/L（NH4）2SO4，3.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，0.4 μmol/L上游和下游引物，1 U Taq DNA聚合酶，0.5 μg DNA。PCR反应条件：95℃5 min变性，后接35个循环。95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，最后72℃延伸7 min。PCR反应结束后，在2%琼脂糖凝胶上鉴定PCR反应结果。用限制性内切酶Bme13901酶切PCR产物，反应条件为10×Buffer 1.5 μL，Bme13901 8 U，PCR产物11 μL，H2O补足体积至15 μL，37℃孵育16 h，酶切反应液在3.5%琼脂糖凝胶行电泳，电泳结束后用凝胶成像系统拍照。血总胆固醇（TC）和三酰甘油（TG）用酶法测定，血HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇（LDH-C）用直接一步法测定。

表1 冠心病组和对照组临床资料比较

1.3 统计学分析 采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。组间基因型及等位基因频率的差别用χ2检验，组间及组内血脂水平比较用t检验，2组等位基因分布进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR扩增产物的酶切鉴定 ABCA1启动子-14 bp C→T置换基因型PCR产物经Bme13901酶切，琼脂糖凝胶电泳呈现3种基因型，野生型CC纯合子存在Bme13901的酶切位点（CCGG）可被酶切，出现91 bp和41 bp电泳条带，变异型TT因-14 bp位点发生C→T置换酶切位点消失，因此出现132 bp电泳条带，CT杂合子出现132、91、41 bp共3条电泳条带。41 bp条带片段较小，不易看清，见图1。

2.2 2组血脂水平的比较 冠心病组TC、TG、LDL-C水平均高于对照组，而HDL-C水平则低于对照组，差异有统计学意义，见表2。

表2 2组血脂水平比较 （mmol/L ±s）

表2 2组血脂水平比较 （mmol/L ±s）

*P<0.05

冠心病组对照组t 228 200 TC 5.96±0.73 5.18±0.42 4.937*TG 2.35±0.48 1.26±0.32 2.562*HDL-C 0.54±0.13 0.95±0.22 2.337*LDL-C 2.98±0.32 2.07±0.61 3.865*组别 n

2.3 2组基因型及等位基因频率分布 2组基因型和等位基因频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（χ2=0.071，P>0.05）。全部检测人群中CC型占42.99%（184/428），CT型占51.64%（221/428），TT型占5.37%（23/428）。2组间基因型及等位基因频率分布差异均无统计学意义，见表3。

表3 2组ABCA1基因-14 bp位点基因型及等位基因频率分布

2.4 ABCA1基因-14 bp位点不同基因型的血脂比较 对照组中T等位基因携带者血清中HDL-C水平明显低于非携带者（P<0.05），而血清中TC、TG和LDL-C水平在2组间差异无统计学意义（P>0.05），见表4。

表4 对照组中不同ABCA1基因-14 bp位点基因型的血脂比较 （mmol/L±s）

表4 对照组中不同ABCA1基因-14 bp位点基因型的血脂比较 （mmol/L±s）

*P<0.05

基因型CC CT/TT t n 83 117 TC 5.06±0.43 5.19±0.34 0.246 TG 1.23±0.32 1.27±0.49 0.568 HDL-C 1.17±0.19 0.86±0.23 3.416*LDL-C 2.01±0.32 2.08±0.15 0.357

3 讨论

ABCA1是一种重要的胆固醇流出调节蛋白，能介导细胞内胆固醇逆向转运到细胞外，使之与载脂蛋白A（ApoA）-Ⅰ结合并包装形成HDL的膜转运蛋白。因此，ABCA1是调节血浆HDL及细胞内胆固醇水平的重要膜蛋白，ABCAl的表达水平与动脉粥样硬化的发生关系密切[3]。

多种代谢酶和载脂蛋白的活性以及脂蛋白颗粒的大小改变皆与ABCA1基因突变相关，引起胆固醇逆向转运异常[4]。ABCA1基因变异最常见方式是单核苷酸多态性（SNPs），研究热点为R219K、R1587K、M883I等位点[5]。Tangier病即ABCAl基因突变所致[6]，该基因突变引发胆固醇流出障碍，血浆中ApoA-Ⅰ不能从外周细胞获得胆固醇并包装形成HDL，从而被迅速降解，继之出现了急性冠脉综合征（AS）和低HDL血症等一系列病理改变，提示ABCAl基因突变可导致冠心病的发生。

最近研究表明，ABCA1基因-14 bp位点C→T基因多态性与缺血性脑卒中发生相关[7]，但其与冠心病易患性研究较少。本研究针对天津地区汉族人群进行小样本研究，探讨ABCA1基因启动子-14 bp位点C→T基因多态性与冠心病发生及血脂的关系。冠心病组与对照组中CC、CT、TT这3种基因型频率差异无统计学意义。由于冠心病组患者血脂水平多受降脂药物影响，且服药不规律，难以评价其血脂水平与基因型之间的相关性，故仅在对照组（未服用任何降脂药物）中进行基因型和血脂水平的分析。结果显示，对照组中T等位基因携带者血清中HDL-C水平明显低于非携带者，但T等位基因在冠心病组和对照组间差异无统计学意义。此结果提示ABCA1基因启动子-14 bp位点C→T突变导致HDL-C降低，但并不能证明其可导致冠心病的发生。本研究标本数量过少，且冠心病为多种危险因素协同作用。因此，仍需较大样本进行分子生物学试验研究以进一步阐明两者间的内在联系。

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