鸭绿江鲤鱼种质资源的微卫星分析

闫春梅，张雅斌，郑 伟*，孙效文，常玉梅，毛瑞鑫，刘慧吉，李忠强，肖志国

（1.吉林省水产科学研究院，长春 130033；2.中国水产科学研究院黑龙江水产所，哈尔滨 150070）

鲤鱼（Cyprinus carpio）是我国分布最广、地方种群和养殖品种最多的一种淡水鱼，其养殖历史悠久，养殖产量在水产养殖业中占相当大的比重。近年来，由于酷鱼滥捕、环境污染等不利因素，江河等野生环境中的鲤鱼资源濒临枯竭，严重影响野生资源的生物多样性。随着国家对野生水生生物资源的重视，采取了增殖放流等措施以恢复野生环境中的资源量。由于有些地区缺乏对野生种质资源的保护意识、管理措施和必要的鉴定技术手段，通过人工放流以及养殖品种的逃逸，使养殖鲤鱼品种（如建鲤）进入鸭绿江自然水域，在一定程度上造成野生鲤鱼种质资源的混杂。

微卫星（Microsatellite DNA）通常以1～6个碱基为核心序列。具有多态性高、共显形、检测重复性好、易于鉴定等优点，目前已广泛用于鱼类遗传多样性的研究[1]，如鲤鱼[2]、大麻哈鱼[3]、乌苏里白鲑[4]。本研究采用17对微卫星分子标记，以黑龙江野鲤（HLJL）作为阳性对照、建鲤（JL）作为阴性对照，对2批采自鸭绿江的鲤鱼（YL1，YL2）进行遗传多样性的分析，对其杂合度等数据进行统计分析，以期通过对鸭绿江野生鲤鱼现存群体的种质鉴定，了解鸭绿江鲤鱼的遗传结构特征、种群历史，为其遗传资源的保护提供较为准确的相关信息和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验鱼鳍条样本

本试验4个鲤鱼群体样本分别采自鸭绿江，其中YL1 38尾，采于2009年4月；YL2 28尾，采于2010年4月；鲤的选育品系建鲤30尾，采于2009年4月。黑龙江抚远江段野鲤28尾，DNA样品由黑龙江水产研究所提供；鳍条样本均保存于70%乙醇溶液。

所有样本同步试验。

1.1.2 试剂

微卫星引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成；PCR所用试剂购自于长春TaKaRa公司；其他试剂为国产药品。

1.2 方法

1.2.1 DNA制备

分别对96尾采自鸭绿江的鲤鱼鳍条样本进行DNA提取，每20 mg鳍条加入0.6 mL裂解液（0.5%十二烷基肌胺酸钠，10 mmol·L－1EDTA（pH 8.0），200 μg·mL－1蛋白酶 K），55 ℃温育 1～2 h，并不时轻摇至组织块完全消化，取上清用酚、氯仿、异戊醇混合液（25∶24∶1）抽提 3遍，之后用无水乙醇－20℃过夜沉淀，再用预冷的70%乙醇洗涤1次，自然干燥后加 50～100 μL 0.1×TE（pH 8.0）溶解DNA，经琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA提取质量，并黑龙江水产研究所提供的28尾鳍条DNA样本一起4℃保存备用。

1.2.2 引物

本研究所用的引物均由黑龙江水产研究所提供，微卫星引物序列及复性温度见表1。

表1 微卫星引物序列Table 1 Microsatellite marker sequence

1.2.3 PCR反应程序及产物检测

PCR扩增反应总体积为15 μL，反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性20 s，退火20 s（根据引物设定），72℃延伸30 s（扩25个循环）；72℃延伸10 min。

PCR扩增产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，120 V电泳2～5 h。取下凝胶，用0.1%硝酸银染色液染色，显色后用照相机记录电泳结果，对扩增条带进行分析，记录。

1.2.4 数据分析

根据所获得的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，应用Popgen32软件，进行等位基因频率；平均观测杂合度；平均期望杂合度；有效等位基因数；遗传相似系数；群体间遗传距离等参数计算。再利用PIC计算软件计算平均多态信息含量。

2 结果与分析

2.1 DNA制备结果

对96尾采自鸭绿江的鲤鱼鳍条样本进行DNA提取，结果显示所提取DNA条带清晰，质量较好。抽取的部分样本DNA琼脂糖凝胶电泳见图1。

2.2 PCR扩增结果

17个微卫星标记均能较好的扩增出目的条带。每个座位检测到1～5个等位基因，均表现为多态。引物HLJ036和HLJ338在4个群体的PCR扩增结果见图2。

图1 部分DNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Part of DNA agarose gel electrophoresis

图 2 引物HLJ036（a）和HLJ338（b）在4个群体的PCR扩增结果Fig.2 PCR profile of HLJ036(a)and HLJ338(b)in four populations

2.3 遗传多样性分析

依据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，利用Popgen32软件，计算得出4个群体的微卫星座位分析检测值。检测结果显示，平均观测杂合度为0.5441～0.6563，平均期望杂合度为0.6362～0.6566，有效等位基因数为2.9182～3.0124，平均多态信息含量为0.5728～0.5885，群体间相似系数在0.8747以上，说明这几个群体属于高度多态，相似性较高。聚类分析显示，HLJL与YL1遗传距离最小，亲缘关系最近。建鲤与其他3个群体的遗传距离较大，亲缘关系较远（见表2，图3）。

表2 鲤鱼4个群体的遗传距离和相似性指数Table 2 Genetic identity and genetic distance in four populations

图3 4个鲤鱼群体的UPGMA聚类Fig.3 Dendrogram of the four populations using UPGMA method

3 讨 论

微卫星研究方法是近几年来广为应用的遗传分子标记，变异水平较高，且可通过PCR获得多肽信息[5]，与同工酶等方法相比，更适合亲缘关系较近的种群遗传关系分析[6－7]。

本研究的目的是鉴别从鸭绿江捕获的两批鲤鱼是否为野生品种。对经鉴定确系野生品种的鲤鱼进行人工增殖放流，以增加天然水域的野生品种覆盖率。由于在养殖品种当中，框镜鲤等养殖种类鲤鱼在生物学性状上与野生鲤鱼具有较大差异，可以在眼观上进行辨别，只有建鲤的体长、体色等生物学性状与野生鲤鱼类似，与野生鲤鱼在外观上很难区分，切培育时间长，目前在整个鸭绿江流域广泛养殖，数量巨大，很容易与野生鲤鱼混淆，因此，选择了建鲤作为养殖品种的代表进行对比鉴定。

为筛选鸭绿江流域自然环境中野生鲤鱼亲本，根据鸭绿江流域的可能存在的鲤鱼品系设计本试验。首先考虑到流域内网箱养殖可能逃逸的养殖品种，多年来该流域养殖品种为建鲤，设为阴性对照。以已知的野生的、生存环境相似的鲤鱼－黑龙江野鲤作为阳性对照，先后对66尾捕自鸭绿江流域的鲤鱼亲鱼进行检测。结果表明，所采捕的两批鸭绿江鲤鱼与建鲤处在不同的分支上，与黑龙江野鲤处于同一进化分支上，从表2可见，YL1与的遗传相似指数最高，达到0.9489，YL2与HLJL的遗传相似指数也达到0.9180，显著高于与JL的遗传相似指数，因此可以说，两批鸭绿江鲤鱼与黑龙江野鲤亲缘关系很近，因此，认为所采捕的两批鸭绿江鲤鱼均为野生品种，可以用与增殖放流。

微卫星方法是检测共显性遗传特征的分辨率很高的较新遗传学研究方法，目前已成为种群遗传结构与进化分析的有效分子标记[8－9]。本研究试验结果显示，本研究中的4个鲤鱼群体平均观测杂合度均在0.5以上，平均期望杂合度高于0.6。平均杂合度是被检测位点上群体的杂合子频率，用于检测群体内遗传变异，是群体杂合程度的度量单位[10－11]。本研究中4个群体的平均杂合度均高于0.5，表明各群体的遗传多样性均较高，尤其是YLI，YL2和HLJL三个群体，具有较丰富的育种和遗传改良潜力，应采取相应措施予以保护。

除了杂合度以外，微卫星还可以通过平均多肽信息含量（PIC）来检测位点多态性。当PIC＞0.5时，为高度多态位点；0.25＜PIC＜0.5时为中度多态位点；PIC＜0.25时为低度多态位点[12－13]，本研究中4个群体的平均多态信息含量为0.5728～0.5885，证明本试验中所选微卫星位点都具有高多态性。可以有效地用于群体遗传结构分析。

微卫星方法采用Fis值来衡量群体内杂合程度。对本研究的4个群体的分析表明，4个群体均表现为一定程度的杂合度缺失，造成这一结果的原因可能是试验中所测样本的含量较少，因为试验中所测样本含量过少，无效等位基因的存在等原因都可能导致杂合度计算值偏低[14－15]。

本研究的目的是鉴定4个鲤鱼群体的遗传关系，确定所采捕的两批鸭绿江鲤鱼是否为野生品种，因此，遗传距离和遗传相似度是重要的待衡量指标。在群体的进化研究中，可通过计算遗传距离来鉴定种间遗传结构及分化关系。微卫星研究方法认为遗传距离越远，分化时间越长，杂种优势越大，即遗传距离与分化关系呈正相关。群体间遗传距离只有高于0.05，才可认为群体间发生了分化，否则认为群体间为分化，可进行群间合并[16-17]。因此，为了保存种间遗传变异，必须采用切试可行的方法来测定种间遗传分化。微卫星方法就是较好的可选方法，不仅可以较准确的预测杂种优势及其优劣性，还可以避免盲目的展开杂交试验[18]，为现代遗传育种学研究打下坚实基础。

4 结论

通过本试验确定YL1和YL2群体与养殖品系建鲤不处在同一进化分支上，遗传距离较远。与黑龙江野鲤群体的遗传相似性较高，遗传距离较近，其中YL1与HLJL亲缘关系最近。表明所鉴定的两批采自鸭绿江的鲤鱼均系野生品种，可以用来作为人工繁育的亲本，其培育出的子一代苗种可以用于放流以增加鸭绿江天然水域的野生鲤鱼良种资源，保护自然环境中土著优良品种的质量安全。

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