响应面法优化山楂叶中黄酮提取工艺

周海旭，高 晗，曲良苗，李忠海

(1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410001;2.河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003)

山楂为蔷薇科山楂属(Crataegus L.)植物，其叶片中含有的黄酮类化合物具有降压、降血脂、软化血管、增加冠状动脉流量、助消化等药理作用.随着人们健康观念的更新以及对黄酮类化合物生物活性的认识，其开发利用已成为目前的一个研究热点［1］.黄酮类化合物的来源广泛存在于多种天然植物中，现主要从银杏叶、葛根等天然植物中提取黄酮，但其含量较低，提取效率受到限制［2］.而中国山楂叶资源丰富，价格低廉，富含黄酮类成分，且含量高于传统药食部位果实［3］.本研究以山楂叶为原料，采用有机溶剂提取黄酮抗氧化物质，以总黄酮提取量为指标，采用响应面法优化山楂叶黄酮的提取工艺条件，既为开发新型天然抗氧化剂提供可靠的研究数据，又可提高山楂树的经济价值.

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

材料:冷冻干燥山楂叶，产于新乡.

药品:芦丁、体积分数95%乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯.

仪器:可见分光光度计WFJ7200型，尤尼柯(上海)仪器有限公司;恒温水浴锅 HH-4，金坛市杰瑞尔电器有限公司;循环水式真空泵 SHZ-D(Ⅲ)，巩义市予华仪器有限责任公司;电子天平HZT-A500，福州华态科学仪器有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 标准品溶液的制备 精密量取在120℃干燥至恒重的芦丁标准品20 mg，加一定量的体积分数60%乙醇溶解，放冷，完全转入100 mL容量瓶中，用体积分数60%乙醇定容至刻度，即得0.2 g·L－1的标准品溶液［4，5］.

1.2.2 芦丁标准曲线的测定 取1.2.1中的标准品溶液0，2，4，6，8，10，12 mL 分别置于50 mL 比色管中，加质量分数5%亚硝酸钠溶液1 mL摇匀，放置6 min;加质量分数10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min;加质量分数4%氢氧化钠试液10 mL，再加体积分数60%乙醇至25 mL，摇匀，放置15 min，于510 nm处比色测定吸光度，以吸光度为纵坐标，芦丁含量为横坐标做标准曲线［6］.

1.2.3 山楂叶中总黄酮含量的测定方法 准确称量1.00 g山楂叶粉末置于锥形瓶中，在一定温度下用乙醇提取一段时间后，抽滤;将滤液用体积分数60%乙醇定容至100 mL容量瓶中，摇匀，作为待测液;取2.50 mL 待测液按 1.2.2 所述方法，测定吸光度.根据回归方程，由吸光度计算出被测液中黄酮含量C，然后由C计算出山楂片中总黄酮的含量［7，8］.

山楂叶黄酮提取量/(mg·g－1)=(40×C×10－3/山楂叶重量)×100%

1.3 单因素试验

1.3.1 提取时间对黄酮提取量的影响 准确称取1.00 g山楂叶粉5份，分别置于100 mL圆底烧瓶中，液料比为30∶1，加入25 mL体积分数60%乙醇.于 60 ℃ 条件下分别提取 50，60，70，80 和90 min.

1.3.2 液料比对黄酮提取量的影响 准确称取1.00 g山楂叶粉5份，分别置于100 mL圆底烧瓶中.分别加入液料比为10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1 的体积分数60%乙醇60℃条件下回流提取60 min.

1.3.3 乙醇体积分数对黄酮提取量的影响 准确称取1.00 g山楂叶粉5份，分别置于100 mL圆底烧瓶中，液料比为40∶1，分别加入25 mL体积分数为50%，60%，70%，80%和90%的乙醇溶液，60℃条件下回流提取60 min.

1.3.4 提取温度对黄酮提取量的影响 准确称取1.00 g山楂叶粉5份，分别置于100 mL圆底烧瓶中，液料比为40∶1，用体积分数70%乙醇分别在40，50，60，70 和 80 ℃条件下提取 60 min.

1.3.5 响应面法优化试验 本试验采用Design-Expert 7.1.6软件中的中心组合试验(Central composite design，CCD)设计原理设计响应面试验［9］.根据单因素试验结果，选取乙醇体积分数A、提取温度B和液料比C 3个因素作为试验因素，以黄酮提取量为响应值.试验因素及水平见表1.

表1 山楂叶中黄酮提取响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels in response surface design for flavonoids extraction from hawthorn

2 结果与分析

2.1 提取时间对黄酮提取量的影响

由图1可知，提取时间为60 min吸光度达到最大，超过60 min后呈现下降趋势，故选择60 min为最佳提取时间.

图1 提取时间对黄酮提取量的影响Fig.1 Effects of extraction time on flavonoids yield

2.2 液料比对黄酮提取量的影响

由图2可知，在一定范围内，黄酮提取量随液料比的增大而呈上升趋势，但液料比增大到一定程度后，黄酮提取量逐渐趋于饱和.因此选择液料比在40∶1左右比较适宜.

2.3 乙醇体积分数对黄酮提取量的影响

由图3可知，随着乙醇体积分数的提高，黄酮的提取量逐渐增大.当乙醇体积分数达到70%时，黄酮的提取量最高.超过该体积分数后，黄酮的提取量反而下降，所以选择乙醇体积分数70%左右比较适宜.

2.4 提取温度对黄酮提取量的影响

由图4可知，随浸提温度的升高，黄酮提取量逐渐增加.当浸提温度超过70℃时达到最大值，随后呈下降趋势.因此选择提取温度在70℃左右比较适宜.

图4 提取温度对黄酮提取量的影响Fig.4 Effects of extraction temperature on flavonoids yield

2.5 山楂叶黄酮提取响应面法优化分析

响应面试验共有17个试验点，其中12个析因点，5个中心点，设计及结果见表2.采用响应面分析法分析试验结果，得到以黄酮提取量为响应值的回归方程为:

由表3可知，以黄酮提取量为响应值时，模型P＜0.000 1，表明该二次方程模型显著.说明该模型可以用于指导山楂叶黄酮提取试验设计.各因素对黄酮提取量的影响由大到小依次为乙醇体积分数＞液料比＞提取温度.响应面分析法的图形是特定的响应值对应的各因素构成的一个三维空间，可以直观地反映各因素对响应值的影响，从试验所得的响应面分析图上可以分析出它们之间的相互作用［10］，各因素间交互作用的响应面图见图5.

表2 山楂叶中黄酮提取响应面试验设计及结果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results for flavonoids extraction from hawthorn

表3 黄酮提取量的ANOVA分析Table 3 ANOVA of the constructed regression model of flavonoids yield

由图5可看出，乙醇体积分数与液料比之间的交互作用对黄酮提取量有极显著影响，乙醇体积分数与提取温度之间的交互作用对黄酮提取量有显著影响，提取温度与液料比之间的交互作用对黄酮提取量影响不显著.

经过Design-Expert 7软件的分析，可以得出山楂片黄酮提取的最佳条件，结合试验验证，确定其最佳提取工艺条件为:乙醇体积分数65%、提取温度70℃、提取时间60 min，料液比42∶1.在此条件下黄酮提取量达到 7.44 mg·g－1.

图5 两两因素交互作用对黄酮提取量的影响Fig.5 The pairwise interactive effects of extraction conditions on flavonoids yield

3 结论

本研究首先通过单因素试验分别考察乙醇体积分数、浸提时间、浸提温度和液料比对山楂叶黄酮提取量的影响，在此基础上，采用Design-Expert 7软件的中心组合设计方法设计响应面试验，建立了数学模型，得到了较优的提取工艺条件.结合响应面分析得到的数学模型，预测更优的工艺条件，并进行验证实验，最后得到了黄酮的最佳提取工艺条件:乙醇体积分数65%、提取时间60 min、提取温度70 ℃、液料比42∶1 mL·g－1，在此条件下黄酮提取量可达 7.44 mg·g－1.

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