鸡传染性法氏囊病毒在DF-1细胞系上繁殖特性研究

王永生，周 欣，杨 霞，陈 陆，王川庆，王泽霖

(河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002)

鸡传染性法氏囊病是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的雏鸡的一种急性传染病.目前，该病主要通过疫苗接种来防控，除给雏鸡使用活疫苗免疫外，通常还给种鸡注射灭活疫苗使出壳雏鸡获得母源抗体，使其避免在生命早期感染本病.鸡传染性法氏囊病灭活疫苗通常采用鸡胚成纤维细胞(CEF)培养病毒液来制备，因IBDV在CEF细胞上增殖滴度不高，所以免疫效果欠佳.DF-1细胞是CEF的传代细胞系，具有永生性，可以无限地繁殖，具备比CEF细胞更大的增殖能力［1］，目前已被应用于禽类病毒的增殖、重组蛋白的表达及动物和人类疫苗的生产.鉴于传统工艺培养的IBDV病毒液毒价不高，需要高倍浓缩，增加成本，且容易被外源病原污染，寻找一种新的细胞来替代鸡胚成纤维细胞增殖鸡传染性法氏囊病病毒是亟待解决的问题之一.本试验旨在研究IBDV HQ株细胞毒在DF-1细胞上的培养特性和最佳增殖条件，为用鸡胚源DF-1细胞系代替传统的CEF细胞来培养IBDV，制备高效的传染性法氏囊灭活疫苗奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 鸡传染性法氏囊病病毒 HQ株细胞毒，是国内IBD灭活联苗的制苗毒株，适应在CEF细胞上生长，由河南农业大学禽病研究所分离、鉴定、培育和保存.

1.1.2 鸡胚源DF-1细胞系 从美国典型菌种保藏中心(ATCC)引入，由河南农业大学禽病研究所传代、建细胞库和保管.

1.1.3 试剂 营养液为体积分数10%胎牛血清(武汉三利)的 DMEM/F12培养基(GIBCO，lot:NO.862843).维持液为体积分数2%胎牛血清的DMEM/F12 培养基(GIBCO，lot:NO.862843).葡萄糖测定试剂盒，购自中生北控生物科技股份有限公司(lot:112651).

1.2 方法

1.2.1 IBDV HQ株在DF-1细胞和Vero细胞上的适应性比较 将IBDV HQ株在长成单层的CEF上连续繁殖3代，并按Reed-Muench法［2］测定病毒液的毒价(TCID50·mL－1)，然后作为种毒液，分别在T25方瓶中DF-1单层细胞上和Vero单层细胞上各传5代.每天观察病变情况，在细胞出现80%以上病变时收毒，冻存后测定各代毒的毒价.如无病变出现，120 h后收毒，并以相同方法连续盲传至第5代，收获的毒液冻存后也测定毒价.

1.2.2 IBDV在方瓶中最佳接毒量及最佳收毒时间的确定 取T25方瓶39个，每个方瓶接种细胞3×106个，细胞长成单层后，取出3瓶进行细胞计数，其余分成3组进行接毒.每组接毒量(毒价为8.0 mL－1)分别为 0.5%，1%，2%.于接毒后 24，36，48，60 h从每组各取3瓶，冻存.待取样完毕一起测定毒价，并计算每3个方瓶的平均毒价.根据所测TCID50的最大值确定最佳收毒时间，并计算出最佳的MOI(病毒感染复数即MOI为感染时每1个细胞的病毒感染量，即接入病毒TCID50·mL－1值乘以体积再除以接毒时的细胞总数).

1.2.3 不同pH值对IBDV增殖的影响 取T25瓶9个，每3个1组.每瓶接种细胞3×106个，并按1%量(毒价为8.0 mL－1)接毒.维持液的pH值分别调至 6.6，7.0，7.6，确定病毒增值时维持液的最佳pH值.

1.2.4 不同接毒时间对IBDV增殖的影响 方法同1.2.2，第1组至第4组分别在细胞生长的24，48，72，96 h接毒，比较4个不同时间接毒组的IBDV增殖动态.

1.2.5 不同血清浓度对IBDV增殖的影响 取T25方瓶48个，分成4组.每瓶接种细胞3×106个，并按1%量接毒(毒价为8.0 mL－1).维持液的体积分数分别为0%，2%，5%，8%胎牛血清的培养基(DMEM/F12).比较各不同血清浓度组IBDV增殖动态.

1.2.6 IBDV繁殖时上清毒价与细胞全悬液毒价的关系 取T25方瓶39个，每瓶接种细胞3×106个，待细胞长成单层后取出3瓶进行细胞计数，余下的全部接毒，接毒量为1%(毒价为8.0 mL－1).接毒后，从6 h开始取样，每隔6 h取1次，每次取3瓶，连续取12次.每次取样时先将3瓶上清混匀，取出适量上清后，再将其余液体平均分配到3个方瓶中，冻融后混合作为细胞全悬液.待取样完毕后一起测上清液与细胞全悬液的毒价.另外，将所取上清液同时用于测定糖耗，以了解接毒后IBDV增殖过程中的细胞状态，绘制病毒增殖曲线图和糖耗动态图.糖耗采用葡萄糖氧化酶法(GODPOD)测定［3］，单位为 g·L－1.

2 结果与分析

2.1 IBDV HQ株在DF-1细胞和Vero细胞上的适应性比较

IBDV HQ株按2%～5%接毒量在CEF上连传3代，各代均在48～72 h出现病变，细胞逐步圆缩、脱落，呈拉网状，72 h后收毒，其TCID50为7.0 ～7.5 mL－1.

IBDV HQ株在DF-1细胞上接毒后，第1代就出现病变，TCID50毒价达7.5 mL－1，在 DF-1 细胞上按1%量接毒连传5代，各代均出现明显病变.接毒12 h后开始有病变，24～48 h细胞逐步圆缩，脱落，不同程度的拉网状，36～48 h收毒，其TCID50在8.0 ～8.5 mL－1之间.表明 IBDV HQ 株在 DF-1 细胞上非常适应，较在CEF细胞上更敏感，出现病变快，毒价更高(表1).

IBDV HQ株在接入Vero细胞繁殖的第1代，出现了轻微病变，但细胞没有圆缩、脱落.在以后的4代中，细胞病变情况均不如第1代，没有出现类似于CEF上的细胞病变.测定TCID50，没有毒价，重复试验也取得类似结果.可见经驯化已适应在CEF细胞上生长的HQ株细胞毒与其它法氏囊病毒不同，不易适应在Vero细胞上繁殖.

表1 IBDV HQ株在DF-1及CEF上不同代次的毒价Table 1 The virus titer of different generation of IBDV HQ strain on DF-1 and CEF

2.2 方瓶中IBDV的最佳接毒量及最佳收毒时间的确定

用T25方瓶36个，分成3组，分别按0.5%，1%，2%接毒量接入，接毒后不同时间测定毒价.由表2可知，在这3种不同的接毒量下，IBDV均可在DF-1细胞上增殖，但1%接毒量组最好，最高毒价可达到8.5 mL－1，最高毒价出现在接毒后36 h左右，其余时间毒价也都能维持在8.0 mL－1以上;0.5%接毒量组毒价最高在8.3 mL－1，出现在接毒后36 h，而2%接毒量组只有在24 h时毒价达到8.0 mL－1，以后都逐渐下降.根据以上结果，在方瓶DF-1细胞上培养法氏囊HQ株时最佳的接毒量为1%(毒价为8.0 mL－1)，最佳的收毒时间应在接毒后36 h，此时细胞病变最明显(病变达80%以上).因接毒时细胞长成单层，经计数为7×106个，故计算最佳 MOI约为0.7(TCID50·细胞－1).

表2 不同接毒量及收毒时间病毒毒价Table 2 The optimized inoculation dose and time of harvest virus

2.3 IBDV HQ株增殖时培养液最佳 pH值的确定

从表3中可见，pH值为7.0时，最适合IBDV的增殖，病毒毒价最高，达8.5 mL－1左右，维持时间也较长，从36～48 h都处在高峰期;在pH值为6.6的偏酸性环境中培养时，病毒增殖稍受影响，最高毒价也达 8.5 mL－1，但维持时间较短;而在pH值为7.6的偏碱性环境培养时不利于病毒增殖，病毒最高毒价仅8.3 mL－1，出现在接毒后24 h瞬间，以后逐渐下降.

表3 不同pH值时IBDV增殖的毒价Table 3 The titers of IBDV propagated in different pH

2.4 不同接毒时间对IBDV增殖的影响

细胞计数的结果(表4)可以看出，在细胞传代第1天后细胞的数量迅速增加，在第3天时细胞的生长密度最大，达到9.8×106个.从表4中可以看出在细胞迅速增长的第2天时接毒效果最好，接毒后24～36 h收获(细胞病变80%以上)，毒价可以达到8.5 mL－1.第3 天接毒毒价也可达8.5 mL－1，但维持时间较短.第1和第4天接毒效果不如第1和第2天的好，第1天接毒又比第4天略高.可见IBDV增殖的效果直接与接毒时的细胞状态和数量有关，处在对数生长期的细胞数量愈大，病毒繁殖的滴度愈高，反之则愈低.

2.5 维持液中血清浓度对IBDV增殖的影响

用48个T25方瓶分成4组，研究维持液中不同血清浓度对IBDV增殖的影响，从表5可以看出，用体积分数2%血清含量的维持液培养时，对病毒的增殖最为有利，病毒的毒价最高，可达8.5 mL－1;用无血清的维持液培养IBDV次之，无血清的培养基条件下，病毒可以繁殖，但毒价并不高;在5%和8%的高血清含量下，病毒的增殖受到影响，因而均没有在使用体积分数2%血清含量时的毒价高.

表4 不同接毒时间IBDV增殖的毒价Table 4 The titers of IBDV at different inoculation time

表5 不同血清浓度时IBDV增殖的毒价Table 5 The titers of IBDVwith different serum concentration

2.6 IBDV HQ株在方瓶DF-1细胞上的繁殖动态及上清液与细胞全悬液毒价之间的关系

从图1中可以看出，接毒6 h后上清液与全悬液毒价均呈上升趋势，但在24 h之前上清的毒价略低于细胞全悬液的毒价约0.5个滴度，而在24～36 h之间，它们之间的毒价相同，且维持在同一高峰8.5 mL－1左右.此时收获毒价最高，通常是冻融后取细胞全悬液，或不冻融，直接收取上清毒液.之后在42～66 h之间，上清与全悬液的毒均呈下降趋势，二者高低无明显规律.

2.7 IBDV HQ株病毒增殖时的糖耗动态

在试验2.6中取样测定病毒液毒价的同时，测定其上清液中的残糖量，以每6 h的实际糖耗为纵坐标，以时间为横坐标绘制出病毒增殖时的糖耗曲线(黑色箭头代表接毒的时间，图2)，0 h代表接毒时间，0 h之前为细胞生长期，0 h之后为接毒后病毒增殖期.从图2可以看出，接毒后12 h内，糖耗增加缓慢，12 h后糖耗迅速增长，在18 h出现一个糖耗高峰，但是维持时间较短，约1～2 h，之后糖耗速下降，在24～36 h后，糖耗基本接近0.另外，细胞病变及计数结果表明，接毒前细胞计数为9.7×106，接毒后6 h时细胞无明显病变，细胞数为1.1×107个;18 h时细胞间隙变大，部分细胞圆缩，并有许多细胞脱落死亡，细胞数为7.5×106个，24 h时细胞约有50%脱落，36 h时80%以上的细胞已经脱落死亡，细胞计数结果为2.5×106个.显示在接毒后短时间内细胞并没有停止增殖，所以糖耗继续增长，同时在病毒的剌激下耗糖剧增，但随着病毒大量繁殖，细胞的迅速死亡，糖耗快速下降渐接近0.糖耗曲线图与病毒增殖时的上清毒价曲线图相比，糖耗的高峰要先于病毒毒价高峰的出现，而且糖耗的高峰维持时间更短，糖耗在高峰之后快速下降，当降低到接近0时病毒的毒价最高.显示病毒的毒价和细胞糖耗呈现一定的平行关系，因此在生物反应器中可用测定糖耗来推测细胞生长情况及病毒增殖趋势，并应在糖耗接近0的瞬间及时收获毒液.

图1 方瓶中上清液与细胞悬液之间的关系Fig.1 Retationship between supernatant and cell suspension in cell bottles

图2 病毒增殖的糖耗曲线Fig.2 The Curve of sugar consumption for virus multiplication

3 讨论

Vero细胞是贴壁依赖性细胞，已经广泛应用于疫苗生产.许多学者报道IBDV可在Vero细胞上繁殖，用来生产疫苗.李有根等［4］对IBDV BJ83株在Vero细胞上进行了适应，证明IBDV BJ83株在Vero细胞上有很好的增殖能力，且病毒滴度与细胞的培养代次有关.顾铭等［5］研究发现，法氏囊弱毒株能在Vero细胞上适应和增殖，而且病毒滴度有了很大的提高.但是，本试验将IBDV HQ株细胞毒在Vero细胞连传5代，没有出现明显的细胞病变，表明经过培育、驯化的细胞适应毒IBDV HQ株暂时不能适应在Vero细胞上生长，但是在同源DF-1细胞系上第1代就能适应，之后几代表现出很强的适应和繁殖能力.与CEF相比，DF-1细胞更适合IBDV HQ株的繁殖，接毒后病变出现较快，病毒繁殖的滴度更高，这与 WANG YONGQIANG等［6］用荧光定量PCR的方法研究IBDV在CEF和DF-1细胞上增殖的结果一致.本试验证实，经过培养条件的优化，IBDV HQ株在DF-1细胞上的毒价可达到8.5 mL－1以上，是在鸡胚成纤维细胞上毒价的10倍.

试验表明，要获得高毒价的病毒液，关键因素之一是最佳接毒时间、最佳接毒量(MOI)和最佳的收毒时间.本试验结果显示，在细胞生长到第2天长成单层时，细胞数量，接毒最好.接毒量不是越大越好，而接毒量小，病毒达到高毒价的时间延长，有时不出现最高毒价;接毒量大，病变出现得快，但毒价较低.只有在最佳的接毒量时才可获得最大的细胞数和最高的毒价.因接毒时种毒的毒价和细胞的总数都是变数，所以最佳接毒量应该用每个细胞的病毒感染量来表示，即用MOI来表示更为科学.经测定方瓶中的最佳接毒量为1%(MOI为0.7 TCID50·细胞－1).

病毒在细胞上的增殖曲线和糖耗曲线动态表明，在病毒增殖早期，病毒在细胞全悬液中的毒价要比上清液中的毒价略高，当病毒增殖到最高毒价时，病毒上清液和细胞悬液之间的毒价基本相同，二者有明显的平行关系.因此，我们可根据上清的毒价测定来推断细胞全悬液中的真正毒价.另外，从病毒增殖时细胞的糖耗曲线可看出细胞糖耗高峰要比病毒最高毒价出现的时间提前，说明在病毒的剌激下细胞的代谢活动旺盛，随后细胞在病毒的作用下不断死亡，糖耗也快速下降.李平忠等［7］在研究狂犬病毒接种Vero细胞时，细胞在接毒后还有一个增殖的过程，之后细胞才慢慢死亡，和本文结果相似.在细胞糖耗下降接近于零时，大部分细胞的生命活动已经停止，此时病毒已不再增殖，但病毒的毒价最高.因病毒毒价在高峰过后下降很快，所以把握合适的收毒时间至关重要.通常在糖耗下降至接近0的瞬间收获病毒液最好.这为IBDV HQ株在转瓶和在生物反应器大规模培养病毒提供了参考依据.

石岗等［8］在研究IBDV于Vero细胞上繁殖时得出pH中性条件下最适合IBDV的增殖的结论;顾铭［5］等在研究时也发现了同样的情况，他们推测是维持液的酸碱度对细胞活性及病毒本身双重作用的结果，IBDV对碱性环境的耐受程度不如在酸性环境下［9］.本研究的结论表明，pH值为7.6的碱性环境下和pH值为6.6的酸性环境下病毒的毒价都低于pH值为7.0的中性环境，尤其是碱性环境对病毒繁殖影响最大，因此保持中性环境(如反应器中自动调控pH十分重要)对细胞的生长和病毒的繁殖都很有利，是获得最高病毒繁殖滴度的重要条件.

血清浓度的比较试验表明，用体积分数2%血清含量的维持液对细胞生长最为有利，获得的毒价也最高，与石岗等［8］的研究结果相一致.于大海等［10］研究发现，血清影响病毒增殖可能的原因是血清掩蔽了病毒与细胞的结合位点，导致病毒与细胞结合受阻.因此，选择体积分数2%的血清浓度，既可降低成本，减少血清杂蛋白对病毒繁殖的影响，利于病毒毒价的提高，又可保证细胞生长繁殖所需的营养.

本研究对IBDV HQ株在DF-1细胞上最佳培养条件的研究表明:在方瓶中处在对数生长期的细胞数量接近最大时接毒最好;病毒的最佳接毒量为1%(8.0 mL－1)，MOI为 0.7(TCID50·细胞－1);最佳收毒时间为接毒后36 h左右;病毒培养时的最佳pH值为7.0，最佳的培养基是DMEM/F12，生长液的血清含量为10%，维持液的血清含量为2%.这些优化的条件不仅能提供高毒价的病毒培养液，制备出高质量的灭活疫苗用于生产实践，而且能为下一步利用生物反应器大规模培养IBDV提供参考依据.

［1］MARTIN HIMLY，DOUGLAS N FOSTER，IVAN BOTTOLI，et al.The DF-1 chicken fibroblast cell line:transformation induced by diverse oncogenes and cell death resulting from infection by avian leukosis viruses［J］.Virology，1998，248:295 －304.

［2］陈因良，陈志宏.细胞培养工程［M］.上海:华东化工学院出版社，1992:201－222.

［3］MILLER W M，H W BLANCH，C R WIKE.A kinetic analysis of hybridoma growth and metabolism in batch and continuous suspension culture:effect of nutrient concentration，dilution rate and pH Biotechnol Bioeng［J］.Biotechnology and Bioengineering，1998，32(8):947 －965.

［4］李有根，聂峰光，戚艺华，等.传染性法氏囊病病毒在次代鸡胚成纤维细胞上的增殖［J］.微生物学杂志，1998，18(3):10 －14.

［5］顾 铭，聂峰光，戚艺华，等.传染性法氏囊病病毒弱毒株对Vero细胞的适应性研究［J］.生命科学研究，2000，4(3):197 －201.

［6］WANG YONGQIANG，QI XIAOLE，GAO HONGLEI，et al.Comparative study of the replication of infectious bursal disease virus in DF-1 cell line and chicken embryo broblasts evaluated by a new real-time RT-PCR［J］.Journal of Virological Methods，2009，157:205 －210.

［7］李平忠，沈 伟，余 芬.用微载体培养Vero细胞制备狂犬疫苗［J］.第三军医大学学报，2006，23:131－134.

［8］石 岗，王宏俊，孙惠玲，等.传染性法氏囊病病毒Vero细胞培养条件优化的研究［J］.中国兽医杂志，2000，26(4):5 －7.

［9］殷 震，刘景华.动物病毒学［M］.北京:科学出版社，1997:578－587.

［10］于大海，陈冠春，王笑梅.小牛血清对鸡传染性法氏囊病病毒增殖的抑制机制［J］.病毒学报，1988，4(1):33－37.