贴壁和悬浮状态293T细胞慢病毒包装效果的比较研究

孙克宁，林 峰，朱化彬，郝海生，杜卫华，赵学明，刘 岩，秦 彤，王 栋

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002;2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

源于HIV-1前病毒(HIV-1 provirus)基因组的慢病毒载体，可以高效整合到宿主细胞基因组中，是一种高效转基因载体，可以感染干细胞、神经细胞等多种细胞类型［1，2］，已成功应用于小鼠、牛、猪等动物研究中［3，4］.经过研究，已经产生了三质粒和四质粒慢病毒转基因载体［5，6］.然而关于慢病毒的高效包装还仍然是慢病毒转基因技术研究的一个关键技术环节.慢病毒的包装一般采用脂质体法和磷酸钙法.虽然脂质体转染法具有较好的包装效果，但脂质体法转染试剂昂贵，而磷酸钙法则价格低廉，所以应用较为普遍［7］.然而，磷酸钙转染法受到很多因素影响，试验结果不稳定，又成为该法的一大缺点［8］.关于质粒用量及各质粒比例的研究结果表明，在最佳用量基础上质粒比例的优化结果收效甚微，包装效果并没有因此而得到明显改善［9］.病毒包装是一个病毒载体与包装细胞间的相互作用过程，作为相互作用的2个重要方面，细胞的不同生长和存在状态会实时地、渐进性地影响到两者间的相互关系.因此，转染细胞的存在状态是影响病毒包装效果的最主要因素，而这种关系有可能会对转染效果产生较大影响.本试验比较了转染贴壁和悬浮状态的293T细胞包装慢病毒的效率，以期为相关研究提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料

包装质粒psPAX2(Addgene plasmid 12260)、包膜质粒 pMD2.G(Addgene plasmid 12259)、载体质粒 pWPXL(Addgene plasmid 12257)购自 Addgene公司;磷酸钙法转染试剂:CaCl2·2H2O，NaCl，Na2HPO4等均购自Sigma公司;293T细胞系于液氮中冷冻保存;细胞培养液:DMEM，FBS，双抗等均购自GIBCO公司;质粒提取试剂盒购自OMEGA公司;DNA marker购自天根生物技术公司.

1.2 方法

1.2.1 质粒的制备 按照OMEGA公司提供的Endo-free Plasmid Mini Kit使用说明书进行质粒提取操作.提取后质粒采用质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳进行质量检测.3个质粒上样量均为1 μL，天根的1 kb DNA Ladder上样量为6 μL.用 FluorChem软件分析电泳结果，并计算质粒DNA的浓度.

1.2.2 细胞培养 293T细胞培养液以DMEM为基本培养液，再添加10%FBS和1%双抗.在37℃，体积分数为5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养.

1.2.3 转染试剂的配置 在1个2 mL离心管中混合如下已经配置好的试剂(50 μL 2.5 mol·L－1的 CaCl2·2H2O，10 μg psPAX2，3 μg pMD2.G，12 μg pWPXL，加无菌水补充体积至500 μL)用移液枪吸打混匀.在另1个2 mL离心管中加入500 μL 2×HEPES，将上述质粒与CaCl2·2H2O混合液用移液枪逐滴滴加到2×HEPES溶液中，边滴加边使用另一把移液枪吸打混匀，之后室温下静置10 min，准备进行后续的细胞转染.

1.2.4 转染贴壁状态的293T细胞 293T细胞消化后，用细胞计数板测定其密度.分别取0.5×106，1×106个细胞移植到6孔板中，再补加完全培养基到2 mL，培养23 h后更换培养液，继续培养1 h，然后进行转染.转染时取1.2.3配置的转染试剂200 μL分别滴加到6孔板的贴壁培养细胞中，并晃动6孔板使之混匀，然后将6孔板放到培养箱中培养，12 h后换液并继续培养.

1.2.5 转染悬浮状态的293T细胞 293T细胞消化后，分别取1×106，2×106，3×106个细胞移植到6孔板中，再补加完全培养基到2 mL，立刻进行转染.转染时取上述转染试剂200 μL分别滴加到6孔板的悬浮细胞中，用1 mL移液枪轻轻吸打细胞培养基使之混匀.然后将6孔板放到培养箱中培养，12 h后换液并继续培养.

1.2.6 Lasrt法测定病毒滴度 上述2种转染方法，均于转染后48 h在倒置荧光显微镜下观察细胞转染效果.取转染效果较好的3组，A组:移植数量为0.5×106个贴壁细胞组;B组:1×106个悬浮细胞组;C组:2×106个悬浮细胞组.每组设3个重复，分别于转染48 h后收集病毒上清液.每个重复取病毒液10 μL检测病毒滴度，其余包装好的病毒液全部冻存于－80℃.

293T细胞于消化后以2×104个每孔接种到96孔板，每孔补加完全培养基至100 μL，每8个孔为1个组，共9组.培养24 h后用移液枪吸弃旧的培养基，每孔加90 μL新的培养基.第1个孔加10 μL病毒液，用移液枪轻轻吸打8～10次混匀.从第1个孔取10 μL混合液加到第2个孔，混匀.这样以后每孔依次稀释10倍.最后放到培养箱中继续培养，24 h后换液，之后每隔24 h换液1次.感染后72 h在荧光显微镜下观察转染细胞荧光表达情况.按照江千里等［10］的方法确定计量孔(设为第n个孔)，并数出计量孔中阳性细胞的数量(设为m个，)，如果有2个以上的阳性细胞紧挨着，算作1个细胞.则病毒滴度为m×10n+1TU·mL－1.

1.2.7 转染结果的观测 由于载体质粒pWPXL中带有绿色荧光蛋白基因，所以使用荧光倒置显微镜，在蓝光的激发下可以使表达绿色荧光的细胞发出绿色荧光，便于观察转染效果.

1.2.8 数据处理 采用SPSS软件进行统计分析，对数据进行了方差分析和多重比较.

2 结果与分析

2.1 慢病毒质粒的制备

提取3个质粒后电泳(图1)，泳道1为质粒pWPXL(10.5 kb)，质量浓度为 1.32 g·L－1.泳道2 为质粒 psPAX2(10.7 kb)，质量浓度为 1.13 g·L－1.泳道3 为质粒 pMD2.G(5.8 kb)，质量浓度为0.49 g·L－1.质粒的质量浓度都大于 0.025 g·L－1［11］，介于前人同类研究结果之间［7］，符合慢病毒包装的要求.

图1 3个质粒的电泳结果Fig.1 The electrophoresis result of three plasmids

2.2 293T细胞的转染效果

转染48 h后，倒置荧光显微镜下观察293T细胞的转染结果(图2).转染结果表明，贴壁状态下细胞密度对转染效果影响很大.细胞数量为1×106组，转染时贴壁细胞已经快长满，转染效果很差.细胞数量为0.5×106组，转染时贴壁细胞生长至50% ～70%，转染后荧光强度强于前者，阳性细胞数量也明显多于前者.

悬浮状态293T细胞的转染结果见图3.移植细胞数量为1×106，2×106组，转染效果都比较好.当细胞数量增加到3×106时，转染效果明显变差.推测，当移植细胞数量增加到3×106时，由于细胞数量过多，细胞的代谢废物短时间内迅速积累，使培养液颜色迅速变黄，培养液pH值迅速减小.换液时pH值已经减小到6.28，而细胞数目为1 ×106和2 ×106组的 pH 值分别为7.41，7.01.研究表明，磷酸钙转染的最适 pH值在 6.96～7.60［8］，3 ×106组培养基的 pH 值远超过了最适的转染范围.

从图3－B和图2－D可以看出，2种状态下的转染对细胞造成了不同影响.图2－D中转染48 h后的细胞贴壁比较牢，细胞紧密地连接成片贴在培养皿底面.而图3－B中转染48 h后的细胞聚集成堆，轻轻地贴在培养皿底面.这可能是在细胞转染时，由于悬浮细胞大量吞入磷酸钙沉淀，使得细胞膜损伤严重，使细胞聚集成团、贴壁性变差.

图2 贴壁状态下293T细胞转染48 h的慢病毒包装效果Fig.2 Typical results of lentivirus packaging using adherent 293T cells at 48 h after transfection

2.3 慢病毒滴度检测

采用Lasrt法的病毒滴度测定结果如表1.对3组数据的方差分析结果表明，3个转染组病毒滴度差异极显著(P＜0.01).多重比较分析结果，C组病毒包转效果极显著(P＜0.01)高于A组和B组，而A组和B组间差异不显著(P＞0.05).

表1 慢病毒滴度的测定结果Table 1 Determinated results of lentivirus titration

图3 悬浮状态下293T细胞转染48 h的慢病毒包装效果Fig.3 Typical results of lentivirus packaging using suspended 293T cells at 48 h after transfection

3 结论与讨论

1)以往应用磷酸钙法包装慢病毒时，都是将一定数量的293T细胞移植到培养皿中，培养到细胞完全贴壁并且生长汇合至50%～70%后再进行转染(约24 h)［12］.这时的细胞处在旺盛的贴壁生长状态，其活力要好于刚消化传代的悬浮细胞，此时进行转染，能取得较好的转染效率［2，13］.过了这一时机，虽然能得到更多的待转染细胞，但293T细胞将会受到接触抑制，生长速度逐渐降低，却影响到了转染效率.本研究中图2－C和图2－A的比较结果也表明，生长旺盛时期会有较好的转染效果.这表明采用贴壁状态的293T细胞进行病毒包装时，细胞密度是一个重要的限制因素.这样就不能充分利用培养基所构成的立体空间，无法通过提高细胞数量提高病毒滴度.

2)本研究采用悬浮状态的293T细胞进行病毒包装，取得了很好的转染效果.悬浮状态下，细胞密度可以通过细胞计数板得到相对精确的测定，使得转染的重复性变得很好.并且，可充分利用培养基所构成的立体空间，在一定范围内可以大量地增加细胞数量而不会影响转染效果.本研究在1×106～2×106的范围内都得到了较为理想的稳定的转染效果，最高将6孔板中每孔细胞的数量增加到2×106个而不影响转染效率.从质粒与靶细胞相互作用的空间来考虑，贴壁的细胞只有上表面与磷酸钙沉淀接触，而悬浮状态的293T细胞整个细胞膜表面都有可能与磷酸钙沉淀有接触，这样就提高了与外源DNA结合的机会，增加了转染成功的概率以及进入细胞的质粒数量.另外，在悬浮细胞逐渐贴壁过程中，相邻细胞将围绕周围的磷酸钙沉淀挤压在细胞与培养皿底面、细胞与细胞中间，使外源DNA与细胞的接触更紧密.细胞与磷酸钙沉淀的这种近距离甚至是零距离的接触对外源DNA进入细胞可能也有一定的推动作用.最终，通过转染悬浮状态的293T细胞，病毒滴度比贴壁状态转染时约提高 3.5 倍［1，7］.本方法可以在细胞消化后立即进行转染，有效地克服了包装效果的不稳定性，并通过提高细胞数量获得了更高的病毒滴度，加快了研究进程，提高了研究效率.

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