用EST-SSR标记评价21份黄瓜种质的遗传多样性

刘俊青，李佩芳，胡建斌，李建吾，陶 翠

(河南农业大学园艺学院，河南 郑州 450002)

黄瓜(Cucumis sativus L.)是世界各地广泛栽培的蔬菜作物，其栽培面积仅次于番茄、洋葱和大白菜［1］.中国是黄瓜栽培和生产大国，据FAO统计，2007年中国黄瓜总产量达2 805万t，产值4.6亿美元，产量和产值均居世界第1位［2］.一般认为，黄瓜起源于印度，中国是黄瓜的次级起源中心之一［3，4］.尽管中国黄瓜资源丰富，分布有华北型、华南型、欧洲温室型、欧美加工型等不同类型［5］，但黄瓜遗传背景狭窄是不争的事实［4，6］，这不利于其杂交育种工作的开展.迄今，多种分子标记(如RAPD，AFLP，ISSR，SSR 等)已应用于黄瓜种质资源研究和遗传多样性分析［7］，为其育种研究提供了基础性遗传信息，但这些标记往往是扩增基因组中非表达序列或在基因组中随机扩增，所得到的位点一般与目的基因(控制性状的基因)相距甚远，不能反映功能基因的多态性，这在某种程度上限制了它们的应用.因此，人们期望能够检测到基因内多态性功能位点的分子标记.EST-SSR起源于基因表达序列，其多态性是基因内微卫星位点变异的反映，是一种潜在的功能标记［8］.与常规的分子标记相比，EST-SSR标记能检测到基因内的可变位点，而这些位点很可能与该植物的性状相关，因而可为植物育种提供更有价值的遗传信息.目前，人们已在多种高等植物中开发出大量的EST-SSR标记，并发现这些标记在植物遗传多样性分析中具有较好的实用价值［9］.本研究利用前期从黄瓜EST序列中开发出部分EST-SSR引物［10］，分析不同黄瓜品种的遗传多样性，旨在为黄瓜育种中选择具有真正意义上的多样性的材料提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料包括21份黄瓜自交系或品种，由河南农业大学黄瓜遗传育种课题组提供.这些材料包括 10 份华北型黄瓜(53，57，86，102，107，D01108，D0462，HR，Jinyou30和 Jinyou10)、6 份华南型黄瓜(109，HN007，HN010，HN013，HN016 和 HN022)、4份欧洲温室型黄瓜(D0351，112，D0442和DZ1)和1份野生种“SHG”.其中，4份欧洲温室型黄瓜主要引自荷兰，其他材料是从国内各地收集后选育所得.采用CTAB小量法［11］提取所有黄瓜材料的基因组DNA.

1.2 PCR反应体系和反应程序

SSR引物为从黄瓜EST序列中开发所得［10］.PCR 反应体系 15 μL，包括 1 × buffer，50 ng 模板DNA，1.5 mmol·L－1MgCl2，200 μmol·L－1dNTPs，0.4 μmol·L－1引物，0.75 U Taq 酶，所有反应在PTC－200型基因扩增仪(MJ Research)上进行.反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性50 s，50～58℃退火45 s，72℃延伸1 min，循环30次;最后在72℃保温8 min.

1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染

采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(m丙烯酰胺:V甲叉双丙烯酰胺=19∶1)电泳，上样量3 μL，并在凝胶两侧点上Marker(pUC19 DNA/MspI).在250 V电压下电泳1.5 h，然后按照优化的银染方法染色、照相［12］.

1.4 数据统计

根据ANDERSON等［13］报道的方法计算ESTSSR标记的多态性信息量(polymorphism information content，PIC)，即 PIC=1－ ∑X2i，其中，Xi表示第i种基因型出现的频率.将电泳图上清晰的条带记为“1”，同一位置无带或弱带记为“0”，建立数字化矩阵.利用NTSYS-pc2.10软件对数据进行分析，采用NEI和LI的方法［14］计算各材料之间的相似系数，以UPGMA法对材料进行聚类作图，并进行主坐标(Principal coordinate analysis，PCoA)分析.

2 结果与分析

2.1 EST-SSR引物特征

从前期研究结果［10］中选择出扩增条带清晰的15对EST-SSR引物(表1).这15对引物包括11种重复基元，其中二核苷酸重复2种，三核苷酸重复8种，六核苷酸重复1种.基元重复5～16次，引物E41和E50基元重复次数最低，E56重复次数最高.所有引物的理论产物大小为155～287 bp.这些引物所在的EST的功能涉及有能量代谢、蛋白质合成、转录调控、光合系统等.

2.2 EST-SSR 多态性

利用15对EST-SSR引物对21份黄瓜材料进行了PCR扩增，结果发现，所有引物均能检测到多态性位点.每对引物所检测到的等位基因数在2(EC56)至7(EC31和EC54)之间，总数65个，平均4.33个(表2).所有引物扩增出的等位基因片段大小均在理论值上下波动，说明等位基因变异主要是由微卫星数量变化所致.引物EC39的扩增带谱如图1所示.

PIC值是反映所用引物区分材料的能力，是衡量引物多态性的一个重要指标.为了准确评价各引物的多态性，计算了各对引物的PIC值(表2).引物EC34的 PIC值最高，达 0.748，引物 EC50的PIC值最低，仅为0.177.所有引物的PIC平均值为0.470.按照 BOTSTEIN 等［15］的观点，当 PIC ＞0.5时，该基因座为高度多态性，0.25＜PIC＜0.5时，为中度多态基因座，PIC＜0.25时为低度多态性.在所用的15对EST-SSR引物中，8对引物具有高度多态性，4对引物具有中度多态性，仅3对引物为低度多态性.表明选用的15对EST-SSR引物具有较好的多态性.

表1 15对EST-SSR引物的特征Table 1 Characteristics of 15 EST-SSR primer pairs in cucumber

图1 EST-SSR引物EC39在21份黄瓜材料中的扩增带谱Fig.1 Band pattern of EST-SSR primer pair EC39 among 21 cucumber accessions

2.3 黄瓜种质的遗传多样性

利用NTSYS-pc2.10软件分析发现，21份黄瓜材料的相似系数变幅为0.608 ～0.980，其中DZ1和102相似系数最小，可考虑作为一个比较理想的亲本组合，Jinyou10和Jinyou30相似系数大，它们可能是某个亲本的杂交后代.所有材料的平均相似系数为0.797，即平均遗传距离0.203，证明了黄瓜遗传背景狭窄.采用UPGMA算法对21份黄瓜种质进行聚类作图，结果见图2.在相似系数为0.732水平上，21份黄瓜材料可明显分为2类(Ⅰ和Ⅱ类)，其中 4份欧洲温室型种质(D0442，DZ1，112和D0351)和1份华南型种质HN010聚在I类，其他16份中国本地种质则聚在Ⅱ类.这充分说明外来种质与国内种质遗传背景差异甚大，而华南型种质HN010很有可能具有欧洲黄瓜种质的血缘.Ⅱ类包括10份华北型种质、5份华南型种质和1份野生种，并可再次细分为A，B，C 3亚类.其中A类包括所有的华北型种质和1份华南型种质109，此类种质平均相似系数达0.931，说明华北型黄瓜种质遗传背景十分狭窄.B类种质包括剩余的4份华南型种质(HN022，HN007，HN013 和 HN016)，其中HN016与其他3份种质相似系数较小，可能是一个比较理想的杂交候选亲本材料.C类仅包括1份野生种SHG，它与国内栽培种(华北型和华南型种质)可明显分开，充分说明了野生种和栽培种的遗传差异.

表2 15对EST-SSR引物的多态性Table 2 The polymorphism of 10 EST-SSR primer pairs in cucumber

图2 基于EST-SSR标记的21份黄瓜材料的聚类图Fig.2 A dendrogram of 21 cucumber accessions based on EST-SSR markers

为了更好的反映各材料之间的遗传关系，以EST-SSR标记数据对21份黄瓜材料进行了PCoA分析.第1和第2特征向量分别解释了23.9%和16.0%的变异，前3个特征向量共解释了50.1%的变异.由图3可知，21份黄瓜材料可明显分为3个区域(Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ)，第Ⅰ区包括所有华北型种质和1份华南型种质109，即图2中的A亚类;第Ⅱ区包括4份华南型种质和1份野生种，即图2中的B亚类和C亚类;第Ⅲ区包括所有欧洲温室型种质和1份华南型种质HN010，即图2中的Ⅰ大类.由此可见，聚类分析图和PCoA图对于21份黄瓜材料的划分基本一致.

图3 21份黄瓜材料的PCoA图Fig.3 A PCoA dendrogram of 21 cucumber accessions

3 结论与讨论

3.1 EST-SSR标记在黄瓜遗传多样性评价中的应用

迄今，RAPD，AFLP，ISSR等分子标记已用于黄瓜遗传多样性评价［5，16～18］.在这些报道中，尽管外来种质可与国内种质区分开，但国内种质则难以按照生态类型加以区分.大多研究者认为这可能是由于自由传粉或人工杂交所导致材料遗传背景较复杂的缘故.本研究采用EST-SSR标记研究发现，无论是采用聚类分析还是PCoA分析，绝大部分均可按照地理分布和生态类型不同加以区分.例如，4份来自荷兰的种质可与国内本地材料明显区分，华北型种质与大部分华南型种质亦可明显区分，在聚类分析图中野生种SHG与栽培种区别明显.这充分说明EST-SSR标记在黄瓜遗传多样性研究中具有很好的实用性，而且材料鉴别能力明显优于RAPD，AFLP，ISSR等分子标记.其原因除了采用了具有典型性状的高代自交系(除品种Jinyou30和Jinyou10)外，很有可能是本研究采用了源于基因表达序列的EST-SSR标记，而这些标记所检测的变异位点可能与黄瓜某些性状(如果实性状)相关.利用EST-SSR标记分析了黄瓜近缘种——甜瓜的遗传多样性，结果发现国内栽培种中的薄皮甜瓜与厚皮甜瓜也能明显区分开［19］，这也支持了本研究结果.

3.2 21份黄瓜种质的应用前景

聚类图和PCoA图对21份黄瓜种质的划分基本一致.国内栽培种质主要集中在聚类图中Ⅱ类和PCoA图中的Ⅰ/Ⅱ区，且相似系数较高，意味着在杂交育种中，以这类种质为亲本所获得的F1代杂交优势不明显，黄瓜果实增产空间可能十分有限，但可对个别性状进行改良.例如，HR高抗黄瓜霜霉病，而109低抗霜霉病但综合性状优良，109×HR子代很可能是抗霜霉病的优良品种，从而实现对109抗病性进行改良.野生种SHG基因组包含多种抗病和抗逆基因，由于SHG(聚类图中Ⅱ－C亚类)与国内栽培种质有一定的遗传距离，因此SHG与国内栽培种质杂交后的分离群体(F2)将会出现广泛的基因分离，从中可能选择到具有抗病和抗逆性的栽培种质.4份国外种质和1份国内种质HN010处于聚类图Ⅰ类和PCoA图Ⅲ区，与其他种质有明显的区别，且有较大遗传距离，以其作为亲本与国内栽培黄瓜(特别是华北型种质)进行杂交，不仅有利于实现黄瓜高产育种，还可拓宽国内黄瓜遗传背景，丰富其基因资源.

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