Aβ 16-22聚集及海藻糖抑制其聚集过程的毛细管电泳检测

徐 亮，孙 彬，都文婕，董晓燕

(天津大学化工学院，天津 300072)

Aβ 16-22聚集及海藻糖抑制其聚集过程的毛细管电泳检测

徐 亮，孙 彬，都文婕，董晓燕

(天津大学化工学院，天津 300072)

淀粉质β(amyloid β，Aβ)多肽是阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)的致病蛋白，其疏水核心Aβ 16-22具有重要的研究价值．以Aβ 16-22为模型多肽，利用毛细管电泳检测方法，分析了Aβ 16-22在水溶液和海藻糖溶液中的聚集过程．结果表明，毛细管电泳法不仅能够很好地分离Aβ 16-22聚集过程中单体和部分聚体，实现对多肽聚集过程的快速鉴定和分析，同时也可检测海藻糖对Aβ 16-22聚集的抑制作用．研究结果可为Aβ聚集抑制剂的高通量筛选和AD治疗中的快速诊断提供实验基础．

淀粉质β(Aβ)多肽；Aβ 16-22；毛细管电泳；海藻糖；抑制剂；聚集

朊病毒、Ⅱ型糖尿病以及帕金森综合征和阿尔兹海默症(Alzheimer’s diseases，AD)都与蛋白质的非正常折叠及其形成的淀粉样沉淀物有关[1]．其中AD又称进行性老年痴呆症，是一种普遍的年龄依赖性痴呆症．随着社会人口老龄化的发展，如果缺乏有效的预防和治疗AD的手段，AD患者将急剧增加．

AD的一个主要病理现象是在脑组织神经细胞外，淀粉质β(amyloid β，Aβ)多肽单体聚集成有毒的寡聚体和纤维状结构，进而形成老年斑沉积[2]．目前对于治疗和预防AD的方法主要集中在抑制Aβ多肽的聚集方面[3]，因此，建立一种快速、简捷的检测Aβ多肽聚集过程的方法，对于研究Aβ聚集的抑制机理以及筛选Aβ聚集抑制剂，将有十分重要的意义[2-4]．

毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)法具有高柱效、快速、易于自动化以及样品和缓冲液消耗量少的特点，已广泛应用于生物分子分离与分析中[5]．近年也有关于应用CE进行Aβ聚集情况的分离分析的报道[6-9]．例如，Sabella等[8]用CE方法研究了Aβ多肽1-40和Aβ 1-42在水溶液中的聚集过程，这种方法可以观测到Aβ多肽的聚集过程．Kato等[9]基于CE的方法，采用荧光检测器，建立了分析Aβ 1-42聚集形成的原纤维以及纤维的方法，并用该方法考察了几种小分子物质对Aβ 1-42聚集生成原纤维及纤维的抑制情况．但由于Aβ多肽聚集过程形成的寡聚体既无内源荧光又很难标记荧光物质，故无法用荧光检测，因此该方法不能用于检测寡聚体，也无法筛选其抑制剂．而研究证明，Aβ多肽聚集过程形成的寡聚体具有更高的细胞毒性[10]．

笔者采用毛细管电泳法研究了Aβ,16-22的聚集过程，观察了Aβ,16-22聚集过程中单体及聚体的实际分离效果，考察了Aβ,16-22在水溶液中的聚集情况，并研究了海藻糖对Aβ,16-22聚集过程的抑制作用．开发的方法和得到的实验结果对于快速筛选Aβ聚集的抑制剂具有重要的指导意义．

1 材料与方法

1.1 实验材料

目前普遍认为，Aβ多肽的聚集是导致AD的主要原因，而Aβ多肽包括Aβ 1-39、Aβ 1-40、Aβ 1-41以及Aβ 1-42多种[3,9](多肽序列参见图1)，其中Aβ 16-22是上述所有Aβ多肽均含有的多肽片段，它被认为是Aβ的疏水核心，在Aβ的构象转变中起关键作用[11-13]．因此该片段的聚集性质在某种意义上决定了整个Aβ的聚集特性，能够有效抑制该片段聚集的抑制剂，有可能抑制整个Aβ多肽的聚集．虽然迄今已有大量研究者通过分子动力学模拟考察了该片段的聚集过程[14-16]，但关于该片段的实验研究却鲜有报道．

图1 Aβ多肽序列以及聚集示意Fig.1 Sequence of Aβ peptides and schematic diagram for its aggregation

实验所用Aβ 16-22购自吉尔生化(上海)有限公司，其氨基酸序列为N-Ac-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2，通过C18反相柱液相色谱法检测其纯度为98.99%，相对分子质量为894.09．该肽段N端用乙酰基修饰，C端用氨基修饰．六氟异丙醇(HFIP)购自Sigma公司．超滤膜(截留分子质量3,000,Da)购自北京欣经科生物技术有限公司．所用毛细管(50,μm)购自河北省永年锐沣色谱器件有限公司．所用的其他实验材料均购自天津市光复科技发展有限公司．

1.2 仪 器

毛细管电泳仪购自美国贝克曼公司，仪器型号为P/ACETMCapillary Electropharosis MDQ．

1.3 实验方法

1.3.1 Aβ 16-22样品的准备

将Aβ 16-22溶于纯的HFIP中，配成1.0,mg/mL的溶液，冷冻干燥后，放置在-20,℃冰箱中冻存待用[8]．实验中，上述处理的Aβ 16-22先配成10,mg/mL的DMSO溶液，待Aβ 16-22充分溶解后，再加入20倍于DMSO体积的水或海藻糖溶液(pH＝7.0)，充分溶解．将溶解好的样品用0.22,µm的膜过滤，一部分移入毛细管电泳仪的样品管，其余的密封后室温培养，届时取样进行透射电镜的检测．

1.3.2 用毛细管电泳法检测Aβ 16-22聚集体

在实验中，毛细管柱的有效长度为20,cm(进样端到检测窗口的长度)、总长30.2,cm．所有毛细管均经过NaOH及HCl预处理后使用，详细的管柱处理方法可参见文献[17]．在进行毛细管电泳分离实验时，首先用pH＝5.0～10.0的40,mmol/L的磷酸缓冲液对刚溶解的样品进行分离，分离电压为10,kV．随后用流动相为40,mmol/L、pH＝2.3的磷酸盐溶液，以及含有1.0,mmol/L海藻糖的40,mmol/L、pH,＝2.3的磷酸盐溶液对多肽样品进行分离分析，分离电压为-20,kV．在所有毛细管电泳实验中，控制毛细管温度为17,℃，进样条件为2.1,kPa、4,s，检测波长200,nm．进样前，样品和流动相都要经过脱气处理；每次进样结束后先用过膜水冲洗毛细管，然后用0.5,mol/L的NaOH冲洗毛细管，再用水冲洗；之后用缓冲液平衡，待电流和基线稳定后，再次进样．分别进行了Aβ 16-22在水溶液以及1.0,mmol/L海藻糖溶液中培养不同时间的样品的毛细管电泳分析．

1.3.3 透射电镜成像法观测不同培养条件的Aβ 16-22聚集体

分别取少量在水中和1,mmol/L海藻糖溶液中培养8,d的Aβ 16-22样品，超声15,min使其分散均匀后，取10,μL滴于带有碳支持膜的铜网上，使样品在铜网上停留1,min，用滤纸吸去多余的溶液，再用过膜水冲洗铜网10,s后，用滤纸吸去多余的水分．铜网上的样品用磷钨酸负染色(2,g磷钨酸，溶解到100,mL的水中，再用0.22,µm的膜过滤)染色30,s，吸去多余的染色液，在室温下晾干．将干燥后的样品放入Tecnai,G2,F20场发射透射电子显微镜系统，抽真空5,min，在200,kV加速电压下观察，拍照．

2 结果与讨论

2.1 Aβ 16-22聚集过程的毛细管电泳检测分析

Aβ 16-22为Aβ多肽的疏水核心，其疏水性较强，故其水溶性较差，所以实验中采用DMSO作为助溶剂．本研究使用的毛细管柱为最常使用的熔融石英毛细管柱，该毛细管柱内壁具有较高的硅羟基浓度，硅羟基的pKa值在2.0左右，故当pH＞2.0时，毛细管内壁带有负电荷，管内可产生正向电渗流[18]．文献[17]报道，管内电渗流随pH值的增加而逐渐增大．而毛细管电泳可以使用电渗流为推动力，分析物在电渗流的推动下由进样端运动到检测窗口处得以检测．因此笔者首先选用pH＝5.0～10.0的缓冲液考察了Aβ 16-22样品的出峰情况．结果表明，在所用的pH条件下得到的电泳图中均有一信号较强、峰宽约为1.0,min的峰，经确定，该峰为助溶剂DMSO的吸收峰．图2给出了pH＝7.0时毛细管电泳分离刚配置的Aβ 16-22样品的实验结果．由图2可知，DMSO的峰值及峰宽远远大于多肽样品峰，故部分多肽样品峰可能与DMSO峰重合，无法得到准确的多肽样品分析结果．因此，欲对此多肽样品精确分析，需排除助溶剂DMSO对多肽峰的影响．

图2 多肽样品的毛细管分离图谱Fig.2 Capillary electropherogram separation of peptide sample

参考McCormick[19]分离多肽及蛋白质所用的流动相，笔者采用pH 较低的流动相(pH＝2.3)对样品进行了分析．采用此流动相，管内电渗流较低(电渗流值为0.19×10-8,m2/(V·s))，约为pH＝7.0时电渗流的1/15，多肽在毛细管内根据自身的泳动作用，从进样端泳动到检测窗口处可得以分析检测．而DMSO不带电荷，故其无法移动到检测窗口处，这样即可排除DMSO对样品的干扰．

图3为Aβ 16-22样品从刚溶解到培养3,d的毛细管电泳分离谱图．图3(a)为刚配置的Aβ 16-22样品的毛细管电泳图，图中在5～6,min处有一主峰，定义为M峰，其峰高及峰面积在图3(a)中最大．随着培养时间的增加，M峰的峰高逐渐降低(见图3(b)～(d))，而在M峰之前出现的峰，其峰高及峰面积逐渐增大，这必然是由于多肽在溶液中聚集所致．一般来说，在多肽的聚集过程中，单体会因逐渐聚集而浓度逐渐降低，聚体的浓度则会逐渐增加．根据上述分析初步可推断图3中M峰含有Aβ 16-22单体，M峰之前出现的峰为聚体．

图3 Aβ 16-22在水中不同培养时间下的毛细管电泳Fig.3 Capillary electrophoregrams of Aβ 16-22 of different incubation time in water

另外，从图3可见，随着培养时间的增加，含有Aβ 16-22单体的M峰的峰高及峰面积逐渐减小，而M峰之前表征聚体的峰的数目、峰高及峰面积均逐渐增大，尤其是在培养时间超过1,d后，M峰前出现吸收平台，且随着培养时间的增加，平台高度不断增大．平台的出现可能是因为随着培养时间的增加，聚体的种类及含量不断增加，部分聚体的峰重叠所致．平台高度的增加说明聚体浓度不断增大．本研究用毛细管电泳法只考察了3,d内的聚集情况，这是因为培养3,d后，样品聚集程度进一步增加，导致有肉眼可见的不溶物析出(无结果显示)，无法用毛细管电泳法分离(含有不溶物的样品进行毛细管电泳分离时易使毛细管堵塞)．

如上所述，在图3所用的电泳条件下，管内的电渗流被屏蔽，分析物仅能靠自身的电泳作用从进样端泳动至检测窗口处；因此，分析物的出峰顺序与它们的荷质比大小顺序一致，即荷质比越大的物质，泳动速度越大，越先出峰．在图3中聚体先于单体从毛细管内泳动出来，这说明聚体的荷质比大于单体的荷质比．这一结论与Sabella等[8]的报道中分析Aβ 1-40与Aβ 1-42的聚集情况得出的结论一致．在Sabella等的报道中，用pH＝7.4的磷酸缓冲液对不同培养时间的Aβ 1-40与Aβ 1-42样品进行了毛细管电泳分离检测．在所用的实验条件下，毛细管内有较强的电渗流，分析物在电渗流的推动下由进样端运动到检测窗口处，而样品的泳动方向与电渗流方向相反，即电泳图中单体先于聚体出峰，说明单体的泳动速度小于聚体的泳动速度(样品在管内的运动方向与电渗流方向相同，与自身的电泳方向相反，故越先检测到的峰的泳动速度越小，荷质比越小)[7]．

2.2 海藻糖对Aβ16-22聚集过程的影响

由第2.1节可知，用毛细管电泳法可观测不同培养时间的Aβ 16-22的聚集过程，因此随后研究了海藻糖对Aβ 16-22聚集过程的影响．首先用1.0 mmol/L海藻糖溶液溶解Aβ 16-22样品，为了避免样品在进行毛细管电泳时的组成变化，也向缓冲液中加入了1.0,mmol/L海藻糖．图4(a)为刚配置样品的毛细管电泳图．由图可见，在有海藻糖存在的情况下，刚溶解的样品中只有M峰出现，与没有加入海藻糖的样品相比(见图3(a))，M峰之前没有峰的出现．这说明，海藻糖在样品溶解过程中即可抑制聚集，防止聚集体的产生．为了进一步确认M峰的成分，笔者参考了文献[8]的方法，对样品进行了超滤(截留相对分子质量为3,000)，并对超滤截留的样品进行了毛细管电泳法分离(分离条件与图3相同)，确定M峰的相对分子质量在3,000以内(无结果显示)，故可认为M峰中含有Aβ 16-22的单体，进一步验证了上述推测的正确性．为进一步考察Aβ 16-22在海藻糖存在情况下的聚集情况，笔者随后考察了延长培养时间后Aβ 16-22的聚集情况．图4(b)～(d)为培养1～3,d的聚集情况．由图4可知，培养1,d时，电泳图中2～3,min处，出现聚体峰．但随着培养时间进一步增加，电泳图变化较小．对比图3和图4可知，在有海藻糖存在的情况下，电泳图中没有出现因大量聚体生成而产生的峰平台，这说明海藻糖可有效抑制Aβ 16-22聚集过程中聚体的生成．

图4 Aβ 16-22在海藻糖溶液中的毛细管电泳Fig.4 Capillary electrophoregrams of Aβ 16-22 with different incubation time in trehalose solution

为进一步证明海藻糖对Aβ 16-22聚集过程的抑制作用，用透射电镜观察了海藻糖的加入对Aβ 16-22聚集过程的影响．图5为用透射电镜观察到的Aβ 16-22在水中和1.0,mmol/L海藻糖中培养8,d的聚集情况．可以看到，在不含海藻糖的培养物中(见图5(a))，有大量Aβ 16-22聚集而成的纤维丝生成，这与文献[20]中Aβ寡聚体的形状相同；但在1.0,mmol/L海藻糖溶液中(见图5(b))，没有出现因多肽大量聚集而产生的纤维丝，而只有因少量聚集而产生的小颗粒生成，这说明海藻糖的加入能够抑制Aβ 16-22的聚集．

图5 Aβ 16-22在水和海藻糖溶液中培养8 d的透射电镜照片Fig.5 TEM images of Aβ 16-22 incubated for 8 days in water and trehalose solution

以上结果均证明，在Aβ 16-22的聚集过程中，海藻糖起着重要的作用，合适浓度的海藻糖不仅能促进Aβ 16-22的溶解，也能抑制Aβ 16-22的聚集．

3 结 论

(1)用毛细管电泳法考察了阿尔兹海默症的致病Aβ多肽的疏水核心Aβ 16-22的聚集情况．研究了Aβ 16-22在水溶液中的聚集过程，并且考察了渗透剂分子海藻糖对其聚集过程的抑制作用．结果表明，毛细管电泳法能够很好地分离Aβ,16-22聚集过程中单体和部分聚体；海藻糖能有效抑制Aβ 16-22聚集过程中聚体的生成．

(2)本文方法可用于快速观测Aβ 16-22聚集过程，亦可用于筛选Aβ,16-22聚集的抑制剂，研究结果为Aβ聚集抑制剂的高通量筛选和AD治疗中的快速诊断提供了实验基础．

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Aggregation of Aβ 16-22 Peptide and Its Inhibition Effect of Trehalose Studied Through Capillary Electrophoresis

XU Liang，SUN Bin，DU Wen-jie，DONG Xiao-yan
(School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China)

Incidence of Alzheimer's disease(AD) is considered to be the result of the aggregation of amyloid β (Aβ) peptide in the brain. Aβ 16-22 is regarded as the central，hydrophobic core of Aβ peptide，and it is thought to be important in full length Aβ aggregation. Therefore，study on the aggregation of Aβ 16-22 possesses important research value. In this work，capillary electrophoresis was applied for the study of Aβ 16-22 aggregation in both water and trehalose solutions. Results show that，the Aβ 16-22 monomer and some peptide aggregates can be separated with the presented capillary electrophoresis method. Therefore，the aggregation process of the peptide can be monitored and detected. In addition，this methord can prove the effect of trehalose as an inhibitor on the Aβ 16-22 aggregation. The obtained results and presented method can not only provide a theoretical basis for the pathogenesis of AD，but also provide an experimental basis for the AD's rapid diagnosis and drug screening.

amyloid β(Aβ) peptide；Aβ 16-22；capillary electrophoresis；trehalose；inhibitor；aggregation

Q814.1

A

0493-2137(2011)07-0633-06

2009-11-03；

2010-05-15.

国家自然科学基金资助项目(20876111)；国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(2009CB724705)；天津市自然科学重点基金资助项目(08JCZDJC17100).

徐 亮（1982— ），男，博士，tjuxuliang@yahoo.com.cn．

董晓燕，d_xy@tju.edu.cn..