叶下珠复方对H22肝癌小鼠的体内抑瘤作用研究

李思明 裴晶 李伟 徐福平

叶下珠复方由叶下珠、绿茶和三七叶组成，对于肝癌具有明显的防治作用，具有解毒活血、疏肝健脾的功效。叶下珠是大戟科植物（Phyllanthus urinaria Linn）的全草，具有清热利尿，消积解毒的功效，具有抗乙型肝炎病毒，抗肿瘤作用，抗HSV病毒等广泛药理活性[1-2]，三七为五加科植物三七（Panax notoginseng F.H.Chen）的根，其主要药理活性成分为人参皂苷和三七皂苷R1，R2等，具有多靶点抗肿瘤作用，可通过诱导细胞凋亡和分化等途径发挥抗肿瘤作用[3-4]。绿茶中具有茶多酚、儿茶素和咖啡碱等成分，通过阻断细胞增殖、阻断细胞周期和诱导细胞凋亡等途径抑制肿瘤生长增殖[5]。为考察叶下珠复方对动物移植性肝癌的抑制作用，本文以肝癌细胞H22荷瘤小鼠为模型，探讨不同剂量叶下珠复方对荷瘤小鼠肝癌细胞的影响。

1 材料

1.1 仪器与试剂

SW-CJ-IF超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；十万分之一电子天平（Mettler Toledo AB135-S型）；Milli-Q型超纯水制备仪（美国Millipore公司）。

1.2 实验药物

叶下珠复方颗粒，由广州中医药大学实验室提供；注射用环磷酰胺(CTX)，批号09010321，江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.3 实验动物

KM小鼠，SPF级，64只，雌性，18～22g，广东省医学实验动物中心，动物质量合格证：SCXK(粤)2008-0002。

1.4 瘤株

小鼠肝癌H22细胞株，由广东省中医院中心实验室提供。

2 方法与结果

2.1 小鼠H22肝癌细胞混悬液制备

选取已接种肝癌H22腹水瘤12d，肿瘤生长良好的荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，超净工作台上腹部用碘酒局部皮肤消毒，在无菌条件下取出腹水，置于已消毒烧杯中，加无菌生理盐水稀释成1∶3的瘤细胞悬液，置冰浴低温保持。

2.2 动物造模、分组及给药

在无菌条件下于小鼠右前肢腋窝皮下接种肝癌细胞悬液0.2mL(约2×107个细胞)。将造模成功的荷瘤小鼠随机分为5组，分别为模型对照组，CTX阳性对照组，叶下珠复方低剂量组（0.2g/（kg·d））、叶下珠中剂量组（1.0g/（kg·d））、叶下珠高剂量组（5g/（kg·d）），每组各8只。阳性对照组采用腹腔注射给药，其余各组均采取灌胃给药，每天1次，连续8天，模型对照组给予同容积的生理盐水。

2.3 抑瘤率、脾指数、胸腺指数测定

末次给药24h后，称取小鼠体质量，随后颈椎脱臼处死小鼠，剥取瘤块、脾脏和胸腺，称取质量。计算肿瘤生长抑制率(%)，脾指数，胸腺指数。脾指数、胸腺指数分别为小鼠的脾脏、胸腺的重量与它们体重的比值，肿瘤生长抑制率计算公式如下:

2.4 统计学方法

实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，数据采用均数（±s）进行分析。

2.5 叶下珠复方对H22小鼠肝癌的体重和肿瘤的影响

由表1可见，与模型对照组比较，各给药组小鼠的瘤重均显著性降低（P<0.01）。叶下珠复方低、中、高剂量组的抑瘤率分别为50.3%、49.9%、50.3%。各给药组的抑瘤率与模型对照组相比较均有显著性差异（P<0.01），但叶下珠复方低、中、高剂量组之间的抑瘤率没有显著性差异（P>0.05）。

表1 各药物对小鼠H22肝癌的抑瘤作用（±s，n=8）

表1 各药物对小鼠H22肝癌的抑瘤作用（±s，n=8）

注：与模型组比较,*P<0.01。

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2.6 叶下珠复方对免疫器官脾指数、胸腺指数的影响

研究结果表明（见表2），与模型对照组比较，CTX的脾指数和胸腺指数均显著性降低（P<0.05），叶下珠复方的脾指数、叶下珠复方的低剂量组和高剂量组的胸腺指数没有显著性差异（P>0.05），但叶下珠高剂量组的胸腺指数显著性降低（P<0.05）。

表2 各药物对H22肝癌小鼠脾指数、胸腺指数的影响

3 讨论

脾和胸腺是体内重要的免疫器官，研究结果表明CTX组呈现显著性抑瘤作用的同时，体重、脾指数和胸腺指数均显著降低，叶下珠复方低、中剂量组对荷瘤小鼠的体重、脾指数和胸腺指数均未有明显影响，但叶下珠复方高剂量组与模型组相比较，胸腺指数显著性降低，说明叶下珠复方具有一定的抑瘤作用，并没有降低机体的免疫功能，CTX组和叶下珠复方高剂量可能对机体免疫器官具有一定的抑制作用。

肿瘤的产生和发展与机体免疫功能应答密切相关，而恶性肿瘤发生后又能产生免疫抑制因子抑制宿主的免疫功能[6]。CTX属于抗代谢抗肿瘤药物，本实验中观察到其抑瘤率高达69.4%，显示十分明显的抑制肿瘤作用，但荷瘤小鼠的免疫功能明显降低，与之比较，叶下珠复方在抑制肿瘤的前提下并能显著提高小鼠的免疫功能，此方在防治恶性肿瘤和提高生存质量方面具有潜在的优势，但叶下珠复方高剂量的抑瘤作用机制需进一步研究。

[1]马新宇，裴俊俊.叶下珠药理研究综述[J].齐鲁药事，2006,25（2）：104-105.

[2]张建军,黄育华，晏雪生，等.叶下珠药物血清对人肝癌细胞珠的诱导分化作用的实验研究[J].中国中医药科技，2002，9(5)：289-291.

[3]尚西亮，傅华群，刘佳，等.三七总皂苷对人肝癌细胞的抑制作用[J].中国临床康复，2006,10（23）:121-123.

[4]王婷，杨策尧，申丽娟.三七总皂苷对肿瘤耐药逆转作用的研究进展[J].临床医学，2011，31（3）：109-111.

[5]蒲霞，郭庆喜,龙汉安.绿茶的肿瘤防治作用研究进展[J].华西医学，2008，23（3）:666-667.

[6]Dupage M,Cheung AF,Mazumdar C,et al.Endogenous T cell responses to antigents expressed in lung adenocarcinomas delay malilgnant tumor progression[J].Cancer Cell,2011,19(1):72-85.