盐酸法舒地尔对大鼠癫痫持续状态海马神经元的保护作用

耿 瑜，郑辑英，李光来，薛国芳，郝庆伟

癫痫持续状态（SE）是指连续癫痫发作持续30min或者在其两次或者多次发作的间歇期意识没有完全恢复的状态。SE有很高的致残率和致死率，探索新的更加有效的SE后神经元保护方法有着重要临床意义。盐酸法舒地尔是一种异喹啉磺胺衍生物，主要是通过抑制Rho激酶发挥作用，具有扩张血管、改善脑循环、减轻缺血损伤的作用。本实验旨在观察SE后大鼠脑组织凋亡相关基因XIAP、Caspase－9的表达情况，探讨盐酸法舒地尔干预对SE导致的神经元损伤的影响及其可能的机制，以期为盐酸法舒地尔应用于临床SE的治疗提供可能的动物实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康成年Wistar大鼠54只，体重220g～240 g（山西医科大学实验动物中心提供），氯化锂（中国医药集团上海制剂公司），匹罗卡品（美国Sigma公司），免疫组化试剂盒、DAB显色剂及多聚赖氨酸、Caspase－9一抗（BA2216）、XIAP一抗（BA2621，武汉博士德生物有限公司），盐酸法舒地尔（天津红日医药有限公司）。

1.2 动物分组及模型的建立 Wistar大鼠随机分为对照组（A组）、模型组（B组）、盐酸法舒地尔组（C组）。后两组再随机分为4个亚组：分别用于SE后6h、12h、24h和48h时点。采用国内外公认的氯化锂－匹罗卡品癫痫持续状态动物模型：按体重127mg/kg，18h后经腹腔注射新鲜配制的匹罗卡品30mg/kg。造模成功后所有大鼠随机分为模型组、盐酸法舒地尔组。盐酸法舒地尔组于达癫痫持续状态1h后采用腹腔注射给药50mg/kg，模型组和对照组1h后腹腔注射等量生理盐水。惊厥评分采用Racine评分法，痫性发作行为分级6级。痫性发作持续超过30 min为SE。在SE达1h时，予腹腔注射地西泮10mg/kg，终止痫性发作。

1.3 标本处理 在SE后相应时间点各取大鼠6只，用25%乌拉坦4mL/kg深麻醉后，断头取脑，大鼠脑组织置入4%多聚甲醛中固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋后，在视交叉后海马区连续冠状切片，每片厚5μm。HE染色，光镜下观察形态学变化。

1.4 细胞凋亡检测 采用原位缺口末端标记法（TUNEL法）检测，按试剂盒（POD）提供方法操作，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞计数5个高倍视野下的凋亡细胞数，凋亡指数（apoptosis index，AI）以凋亡细胞/100个细胞表示。

1.5 免疫组化检测 采用SP法，染色步骤按试剂盒说明书进行。显微镜下胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞，每只动物随机取3张切片，每张切片在400倍视野下随机选取不重叠的5个视野，图像输入计算机，采用彩色图像分析系统，分别计数XIAP和Caspase－9染色阳性细胞数，取均数。

2 结 果

2.1 行为学表现 B组大鼠注射匹罗卡品后15min～30min均出现流涎、点头、洗脸样动作；随后出现前肢阵挛，之后很快表现为前肢阵挛伴站立，进一步发展到全身强直阵挛发作伴站立、摔倒，反复发作，均达到Ⅳ级～Ⅴ级发作，呈癫痫持续状态，点燃率为100%。C组大鼠也均达到癫痫持续状态，但潜伏期较长且痫性发作程度较B组轻，多在Ⅲ级～Ⅳ级发作。A组大鼠无癫痫发作。

2.2 TUNEL检测结果 A组仅有少量TUNEL阳性细胞表达，呈散在分布，着色较浅。B组6hTUNEL阳性细胞表达开始增多，并随时间点的延长而增加，24h达高峰，48h减少，与B组相比，C组TUNEL阳性细胞也是在24h达高峰，但相应时间点TUNEL阳性细胞的表达均低于B组（P＜0.0 5或P＜0.01）。详见表1。

表1 3组大鼠SE后海马TUNEL阳性细胞数（±s）

表1 3组大鼠SE后海马TUNEL阳性细胞数（±s）

组别6h 12h 24h 48h A组1.87±0.26 B组 14.93±1.03 28.53±1.37 36.61±1.38 28.35±1.20 C组 13.30±1.22 17.66±1.16 27.49±1.34 19.83±1.12 P＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 AP和Caspase－9检测 A组大鼠海马未见XIAP和Caspase－9阳性细胞出现。B组6h有大量XIAP和Caspase－9阳性细胞出现，12h到达高峰；C组与B组相比，各时间点XIAP阳性细胞数均显著增加（P＜0.05），Caspase－9阳性细胞数均显著减少（P＜0.05）。详见表2、表3。

表2 B组与C组大鼠SE后海马XIAP阳性细胞数（±s）

表2 B组与C组大鼠SE后海马XIAP阳性细胞数（±s）

组别6h 12h 24h 48h B组 13.28±6.47 22.12±7.25 15.97±8.12 10.51±4.31 C组 24.51±9.07 39.30±12.94 22.77±12.23 19.99±4.42 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表3 3组大鼠SE后海马Caspase－9阳性细胞数（±s）

表3 3组大鼠SE后海马Caspase－9阳性细胞数（±s）

组别6h 12h 24h 48h B 组 34.92±10.77 54.01±14.11 41.35±10.59 38.85±9.76 C组 20.58±7.53 36.37±12.57 28.07±7.37 20.13±9.08 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 讨 论

目前认为至少有三条信号通路参与细胞的凋亡：线粒体通路、死亡受体通路、内皮网通路。Caspase是细胞凋亡的核心，在这三条凋亡通路中几乎涉及Caspase的级联反应［1］。凋亡过程可划分为启动、效应、降解3个功能截然不同的阶段，而Caspase－9是最主要的凋亡启动分子，是线粒体凋亡途径的关键蛋白酶，处于Caspase“瀑布式”的顶端，它可以启动Caspase的级联反应，并激活下游的Caspase－3，从而完成对其相应底物的切割，引起细胞凋亡［2］。

XIAP是一种细胞内源性的抗凋亡蛋白，属于凋亡抑制蛋白家族（IAPs）。而XIAP是该家族中结构最典型、作用最强、功能最全面的Caspase抑制因子。它含有三个结构域：BIR、RING和CARD，其中特征性功能结构为氨基端的3个BIR结构域：BIR1、BIR2和BIR3。XIAP主要通过BIR3结构域与Caspase－9单体相结合，形成异源性二聚体，使Caspase－9失去单体结构而丧失其催化活性，当BIR3结构域发生突变后，XIAP将会失去对Caspase－9的抑制作用。

盐酸法舒地尔是一种Rho激酶（ROCK）特异性抑制剂，起初认为其仅是一种细胞内钙离子拮抗剂，可以抑制蛋白激酶A/C/G和肌球蛋白轻链激酶，从而使血管平滑肌舒张、血管扩张［3］。脑缺血后缺血神经元轴突内ROCK蛋白表达增加、活性增强［4－6］，盐酸法舒地尔不仅可以通过以上的作用机制来缓解脑缺血症状，还可以通过直接作用于受损的神经元而发挥神经元保护作用。本实验研究表明，预先给予盐酸法舒地尔不仅能延迟SE出现的时间，并且能减轻癫痫发作级别以及神经元的损伤程度；盐酸法舒地尔可能是通过上调SE大鼠脑组织XIAP的表达而抑制Caspase－9产生，从而发挥神经元保护作用。

［1］ Thornberry NA，Lazebnik Y.Caspases：Enemies within［J］.Science，1998，281（5381）：1312－1316.

［2］ Fujita E，Egashira J，Urase K，etal.Caspase－9processing by caspase－3via a feedback amplification loop in vivo［J］.Cell Death Differ，2001，8（4）：335－344.

［3］ Masahiro T，Hiroshi N，Hideo Y，etal.Development of specific Rho－kinase inhibitors and their clinical application［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2005，1754：245－252.

［4］ Yano K，Kawasaki K，Hattori T，etal.Demonstration of elevation and localization of Rho－kinase activity in the brain of a rat model of cerebral infarction［J］.Eur J Pharmacol，2008，594（1－3）：77－83.

［5］ Yamashita K，Kotani Y，Nakajima Y，etal.Fasudil，a Rho kinase（ROCK）inhibitor，protects against ischemic neuronal damage in vitro and in vivo by acting directly on neurons［J］.Brain Res，2007，1154：215－224.

［6］ Huang L，Li Q，Li H，etal.Inhibition of intracellular Ca2＋release by a Rho－kinase inhibitor for the treatment of ischemic damage in primary cultured rat hippocampal neurons［J］.Eur J Pharmacol，2009，602（2－3）：238－244.