多发性骨髓瘤浆细胞标记指数检测的临床意义研究

许戟 李春溟 张森森 郜晓 屈晓燕 陈丽娟 李建勇 许家仁

多发性骨髓瘤 (multiple myeloma，MM)是以骨髓中克隆性浆细胞恶性增殖和异常积聚为特征的肿瘤。异常浆细胞浸润骨骼和软组织，产生M蛋白，引起骨骼破坏、贫血、肾功能损坏和免疫功能异常。其临床经过及预后差异很大，疾病呈现明显的异质性。核型异常是MM主要预后因素之一，最常见有13号染色体部分或全部缺失del(13q14)，是一个独立不良预后因素［1］。目前，判断MM患者预后的另一重要因素浆细胞标记指数(plasma cell labeling index，PCLI)在国内尚未开展。本研究应用免疫荧光玻片计数法检测MM患者中PCLI，并应用间期荧光原位杂交(interphase fluorescence in situ hybridization，I－FISH)技术检测13q14缺失［del(13q14)］，探讨PCLI与年龄、疾病分期、骨髓浆细胞数、β2－微球蛋白(β2－MG)、白蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐、疾病无进展生存期(PFS)及del(13q14)等的相关性。

1 对象与方法

1.1 病例 42例初治MM患者，诊断标准参照张之南主编的《血液病诊断与疗效标准》［2］。根据 Durie－Salmon分期和国际分期系统(ISS)分期法分期。男26例，女16例，年龄33～73岁，平均(56.5±7.8)岁。Durie－Salmon分期:Ⅰ期4例，Ⅱ期3例，Ⅲ期35例;ISS分期:Ⅰ期6例，Ⅱ期21例，Ⅲ期15例;根据M蛋白类型分为:IgG型24例，IgA型9例，κ轻链型5例，λ轻链型4例。

1.2 PCLI检测 是用玻片为基础的免疫荧光法来测定。密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞。每1×106细胞在37℃，1640培养液中孵育1 h。用PBS冲洗后，滴片，待玻片干燥用95%酒精固定10 min。加入 20 μg AMCA－Bu－1 单抗，室温下孵育 30 min，于PBS中晃洗2 min。加入8 μg AMCA山羊抗兔IgG，室温下孵育30 min，于PBS中晃洗2 min。加入单一特异性AMCA山羊抗人κ或λ，室温下孵育30 min，于PBS中晃洗2 min。片干后滴加DAPⅡ 6μl，待15 min后镜检。在Leica DRMA2型荧光显微镜下计数200个胞浆染为蓝色的浆细胞，以胞浆轻链特异性细胞核染色的细胞数≥1%定为阳性标准［3］。

1.3 MACS法分选纯化浆细胞 具体参照说明书，即密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞;用PBS制备细胞悬液(每5×106个细胞加90 μl PBS);每5×106个细胞加 CD138 磁珠(Milteny，Germany)10 μl，4 ℃孵育15 min;过柱分离浆细胞，将纯化的浆细胞低渗固定处理后收获细胞，－20℃冻存。

1.4 I－FISH 采用针对13q14的特异性 DNA探针D13S319(购自北京金菩嘉)检测13q14缺失。取－20℃储存的染色体及对照组标本，按产品说明书操作，予以变性、杂交、洗片、复染，见参考文献［4］。采用装有CCD(冷光源照相机)的Leica DRMA2型荧光显微镜下行原始荧光图像采集。每例至少观察200个间期细胞，计数边界清楚、无重叠、结构完整的细胞核。对10份染色体核型正常的非血液系统恶性疾病患者外周血淋巴细胞进行相应探针检测，以阳性细胞数≥+3s作为标准。del(13q14)阳性标准为＞20%。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件分析。Fisher精确检验用于组间离散变量的比较，使用logistic回归模型进行多因素分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCLI检测 骨髓瘤细胞的胞浆经κ或λ染色后，胞浆染为蓝色，非瘤细胞胞浆不着色。PCLI阳性浆细胞胞核荧光染色为蓝色，而阴性胞核未染色。42例患者 PCLI中位数为 0.5%(0～4.46%)，18例(42.9%)PCLI阳性，即PCLI≥1%。

2.2 del(13q14)检测 用D13S319位点的探针检测，42例患者中25例(58.8%)发现有13q14的缺失，即只见1个桔红色信号。

2.3 PCLI与 del(13q14)的关系 18例 PCLI阳性MM患者del(13q14)阳性14例，阴性4例;24例PCLI阴性患者del(13q14)阳性12例，阴性12例。PCLI阳性患者del(13q14)发生率较阴性患者高(P＝0.006)。

2.4 PCLI与临床参数的相关性 PCLI阳性与年龄、疾病分期、骨髓浆细胞比例、β2－MG、白蛋白、LDH、肌酐等无相关性(P值均＞0.05)，与疾病生存期(P＝0.023)和del(13q14)(P＝0.006)之间有显著的相关性。见表1。进一步多因素分析显示 PCLI和 del(13q14)两者之间有强相关性(P＝0.009)。

表1 42例MM患者PCLI与各项临床分类指标相关性的统计分析

2.5 PCLI与 PFS的相关性 随访22.5月，18例PCLI阳性患者，7例疾病进展，而24例PCLI低表达患者仅有4例疾病进展，PCLI高表达患者PFS(8.5月)短于低表达患者(13.5月，P＜0.05)，见图1。

图1 PCLI阳性与阴性PFS曲线比较

3 讨论

PCLI特异性反应克隆性浆细胞的增殖程度，PCLI高的患者对治疗反应快，但缓解期短，中位存活期也短。在多变量分析中，PCLI被证实是初诊MM患者一个独立的预后因素［5－6］。文献报道PCLI阳性及阴性2组中位疾病进展时间及总生存期都明显缩短，但PCLI阳性组缩短更明显，表明MM进展更快，预后更差［5］。Fonseca等［1］亦证实PCLI阳性者较 PCLI阴性者生存期短，因而针对此类病人临床应早期强化治疗，缓解后尽早移植，以期延长生存期。本研究亦发现PCLI阳性组与生存期短明显相关，中位生存期仅为8.5月，部分患者化疗后未获缓解即疾病进展，失去移植机会。

del(13)是MM最常见的核型异常之一，是MM患者一个独立的不良预后因素，常规化疗缓解率低，病人生存期短［1］。Zojer［7］等采用 I－FISH 检测 104 例 MM患者，del(13q14)的检出率为46.2%，与Durie－Salmon分期、β2－MG及浆细胞比例密切相关。相对于正常核型而言，伴有del(13)者常属于Ⅲ期，β2－MG及浆细胞比例明显增高。研究表明伴有del(13)者PCLI明显增高，而PCLI阳性率高者易发生del(13)，疾病进展快，总生存期短［1］。本文结果显示 PCLI和 del(13q14)两者之间有强相关性(P＝0.009)，与文献报道相符。由此说明PCLI结合del(13q14)可准确判断MM预后，对临床评估病情、治疗选择可提供有力的帮助。有研究表明，此类患者适宜采用强效化疗及移植，有助于降低死亡率，明显改善预后［8－9］。因而，宜在缓解早期行干细胞移植可望获长期生存。

多元分析显示，PCLI阳性者与年龄、分期、β2－MG、白蛋白、血钙、血肌酐等无明显相关性，这与文献不符合［1］，原因可能与研究的例数或者患者存在未检出的复杂染色体有关。

总之，PCLI与del(13q14)作为MM患者独立预后因素，二者相结合，必然提高该病预后判断的准确性，具有广泛的临床应用价值。

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