竹种内转录间隔区的核苷酸(ITS)序列分析

杜健伟，于 瑶，张汉尧

(西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室，云南 昆明 650224)

内转录间隔区ITS(Internal Transcribed Spacer)序列，是在真核生物基因组中的核糖体中相对保守的序列，同时它存在于高度重复的核糖体中，进化相对迅速而具多态性且长度不大，具有种内变异小而种间变异大的特性，因此是理想的种间鉴定的遗传标记［1］。目前，ITS序列分析已广泛的应用于被子植物的种内属间及种间遗传关系以及系统发育和分类研究［2－4］。通过对西南林业大学校园内3个不同竹种的ITS序列的分析，并构建它们的系统树，从分子角度探讨3个竹种的分类地位，并为种属间鉴定提供分子依据。

本研究使用竹子新鲜叶片基因组中的ITS基因对慈属，刚竹属，牡竹属的3个竹种进行种间系统关系的研究，从分子水平分析不同属间的竹种之间的亲缘进化关系。目前，应用ITS基因对不同属竹种间进行系统分类研究在国内尚未见报道。

1 实验样本

实验用慈竹Neosinocalamus affinis(Rendle)Keng f.，龙竹Dendrocalamus giganteusMunro，紫竹Phyllostachys nigra(Lodd.Ex Lindl.)Munro，均采自西南林业大学校园内。采集3个竹子的新鲜叶片，用液氮将新鲜叶片放入预冷后的研钵中研磨后，放入超低温冰箱(－80°)保存。

2 实验仪器和试剂

SX－500高压蒸汽灭菌锅，PCR仪型号为PTC—100型，DZKW电热恒温水浴锅，BS223S电子天平，SW—CJ—2F清洁工作台，5804R离心机，DYY－8C型电泳仪BIO－RAD凝胶成像仪。

引物以及PCR体系2×Taq PCR MasterMix均由昆明硕阳科技有限公司合成及供应，DNA提取试剂盒(离心柱型)为BioTeKe品牌，其余试剂均为分析纯。

3 实验方法

3.1 叶片DNA的提取

用BioTeKe新型快速植物基因组DNA提取试剂盒提取。

3.2 ITS基因序列的PCR扩增

根据GenBank中竹子的ITS基因序列设计一对特异性引物扩增竹子ITS基因。①引物:上游引物:5'GAT ACT TGG TGT GAA TTG CAG A 3';下游引物:5'TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3'。②反应体系:上游引物 2 μl;下游引物2 μl;2 × Taq PCR MasterMix 25 μl;DNA 模板 2 μl;加灭菌水至 50 μl。③反应条件:预变性:94℃ 6 min;变性:94℃ 30 s，退火:50.8℃ 30 s，延伸:72℃ 90 s，40 cycles;终延伸:72℃ 8 min，产物于4℃ 保存。④PCR产物检测:PCR产物5 μl用EB染色的浓度为0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像仪照相。

3.3 测序

将剩余PCR样品45 ul，委托中美泰和生物技术(北京)有限公司测序，采用双向测序。

3.4 系统发育树的构建

序列的比对采用软件 Clustal X 2.0［5］。利用BioEdit version 7.0.5 软件进行人工调整［6］。运用系统分析和系统发育分析软件MEGA 4.1。进行系统发育分析，以最大简约法(Maximum parsimony，MP)构建系统发育树，应用自展法(Bootstarp，1000 replicates)进行可信度检测，空位作为完全缺失(Complete deletion)处理，转换(Transition，Ti)和颠换(Transversion，Tv)设置为相同的权重，模型选择核酸－P－distance。

4 实验结果与分析

4.1 样品ITS－PCR

慈竹，龙竹，紫竹的基因组DNA经PCR扩增后获得了单一的目的条带，PCR产物的rDNA ITS区域的序列片段长度大约为300 bp～400 bp。PCR扩增获得的目的片段含有5.8S rDNA片段，ITS2全长，以及26S rDNA片段序列，分别将3条序列提交给NCBI公用数据库GeneBank，选取刚竹属，牡竹属，慈属覆盖度80% ～90%的竹种(表1)，利用NCBI的软件BLAST进行网上对比。

表1 供试竹类植物材料Table1 Bamboo species used in this study

4.2 样品ITS序列分析

利用Clustal X 2.0对DNA序列完成排序，并按Kimura－2参考模型用MEGA软件计算序列间的分化距离，得到Kimura－2参数遗传距离(Kimura－2 parameter genetic distance)，使用 MEGA 4.1 软件1000次重复抽样计算出邻近树(NJ)。

经软件Clustal X 2.0和MEGA 4.1分析表明，3个竹种的ITS序列长度范围为381 bp～390 bp，其中A，T，G和 C碱基的平均含量为别为16.1%，10.7%，34.2%，39.1%。ITS为339个位点(空位作为缺失处理)，恒定位点281个，Parsim-info简约信息位点39个，variable变异位点为54个，Singleton单个碱基变化位点15个。5.8 s片段，ITS2，26 s片段的3个区变异较大，因此适用于作系统发育分析。

4.3 构建系统发育树

用最大简约法构建系统发育树如图1所示，慈竹、龙竹和簕竹属的两个竹种与牡竹属的5个竹种聚为一类，紫竹与刚竹属的4个竹种聚为一类，结果表明利用龙竹和紫竹在同属之间的亲缘关系较近，这支持了现在目前有关于龙竹与紫竹的系统分类，而在系统发育树中可以看出慈竹与牡竹属的竹种亲缘关系较近，这为利用ITS序列对竹类植物的系统分类提供了理论依据。

图1 用MEGA 4.1软件对数据矩阵进行NJ分析得到竹种系统树

5 讨论

试验中采集的材料均采自西南林业大学校园内，可能存在因人工栽培而造成的种质漂移的可能性。将测序后所得ITS序列在BLAST上进行网上比对，选取覆盖度80% ～90%的同属竹种(慈竹选取簕竹属两个竹种)进行序列分析及构建系统发育树。本文对慈竹，紫竹，龙竹3个竹种的ITS进行分析和讨论，为3个竹种在植物分类学的研究上提供了分子水平证据和基础资料。

从已发表的论文来看，前人已有较多关于利用ITS序列分析研究植物的系统发育文章，如郑曼莉等利用ITS(nrDNA)和matk(cpDNA)探讨姜族植物的系统发育［7］，李璐滨等利用叶绿体5S rDNA ITS和matK基因序列对刚竹属植物系统分类进行的的可行性分析［8］。被子植物ITS1区与ITS2区的序列长度变异很小(均小于300 bp)，但我们的结果不支持这一结论，因为实验用的3个竹种的ITS序列长度范围为381 bp～390 bp。本研究通过对3个竹种与相应属竹种序列比较分析表明，利用ITS序列对竹种的系统分类有一定的借鉴作用。因为在探讨一些被子植物科内的系统发育时，ITS区提供的信息是很有价值，它使我们对被子植物系统进化的认识又向前跨了一步［9］。

［1］ CHU K H，LI C P，HO H Y.The first internal transcribed spacer(ITS1)of ribosomal DNA as a molecular makers for phylogenetic and population analyses in crustacean［J］.Mar Biotechnol(N Y)，2001，3(4):355～361.

［2］ 李建强，王恒昌，李晓东，等.基于细胞核rDNA ITS片段的水青冈属的分子系统发育［J］.武汉植物学研究，2003，21(1):31～36.

［3］ 李学营，彭建营，白瑞霞.基于核rDNA的ITS序列在种子植物系统发育研究中的应用［J］.西北植物学报，2005，20(5):829～834.

［4］ 赵志礼，徐珞珊，董辉，等.核糖体DNA ITS区序列在植物分子系统学研究中的价值［J］.植物资源与环境学报，2000，9(2):50～54.

［5］ Larkin M A，Blackshields G，Brown N P，et al.Clusta1 Wand Clustal X version 2.0［J］.Bioinformatics，2007，23:2947 ～ 2948.

［6］ Tamura K，Dudley J，Nei M ，et al.MEGA4:molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2007，24:1596 ～1599.

［7］ 郑曼莉，夏永梅.利用ITS(nrDNA)和matK(cpDNA)探讨姜族植物的系统发育［J］.云南大学学报(自然科学版)，2010，32(S1):426～432.

［8］ 李潞滨，刘蕾，袁金玲等.叶绿体5S rDNA ITS和matK基因序列应用于刚竹属植物系统分类的可行性分析［J］.分子植物育种，2009，7(1):89 ～94.

［9］ Baldwin B G，Sanderson M J，Porter J M，et al.The ITS region of nuclear ribosomal DNA:a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny［J］.Ann Missouri Bot Gard，1995，82:247 ～277.