压电生物传感器及其信号放大技术

晋晓勇，张旭明

（宁夏大学化学化工学院，能源化工重点实验室,宁夏银川750021）

0 引言

早在1962年，Clark在氧电极的基础上提出了研制葡萄糖酶传感器的设计原理。1967年Updike和Hicks将固定化的葡萄糖氧化酶膜结合在氧电极上，制成了第一代生物传感器[1]。经过40多年的发展，随着现代测量技术、分子生物学、生物电子学和仿生学的迅猛发展及相互结合，生物传感技术在基础研究、应用研究、新产品开发和商品化等方面都取得了长足进展[2～4]。

生物传感器（biosensors）是以固定化的生物体成分（酶、抗体、抗原、核酸等）或生物体本身（细胞、细胞器、组织等）作为敏感（识别）元件的传感器[2,4]。其基本原理是利用敏感（识别）元件（酶膜、抗体膜、生物表皮、细胞器等）与被测样品之间发生高度选择性的生物化学反应并产生电、热、光、质量等的变化，通过转换元件（换能器：电极、热敏电阻、光纤、压电晶体谐振器等）将这种变化转换为电信号[2,4～5]。生物传感器基本组成如图1所示。

由于生物传感器广泛应用现代测量技术中的各种最新方法，因此与传统的分析检测手段相比具有以下优点：

a.生物传感器是由具有高度选择性的生物材料构成敏感（识别）元件，因此检测时一般不需要进行复杂的样品预处理和另加其它试剂。

图1 生物传感器的基本组成Fig.1 The basic compositions of a biosensor

b.体积小，可以实现连续在线监测。

c.灵敏度高，响应快，样品用量少，可以重复多次使用。

d.传感器连同测试系统的成本远远低于大型仪器，便于推广普及。

在生物传感器中，利用压电石英谐振器对质量的敏感性，通过谐振器结合待测物后频率的变化来检测的一类传感器称为压电生物传感器[6～7]。 压电生物传感器（piezoelectric biosensors，PEBS）是把电子学、机械学、分子生物学等学科结合在一起的新型生物传感器。这类传感器最大的优点是不需要任何标记，且仪器简单、操作方便。因此引起了人们的浓厚兴趣，成为生物传感器领域的研究热点之一[8]。

1 压电分析技术基本理论

1880 年，Jacques Curie和 Pierre Curie[9]首先发现压电现象。晶体压电理论首先是由雅克·居里和皮埃尔·居里于1880年提出的，1959年Sauerbrey[10]提出了气相中晶体表面所载质量与谐振频移的Sauerbrey方程：

方程中：Δf—晶体吸附外来物质后振动频率的变化（Hz）；k—常数；f—压电晶体的基本频率 （MHz）；Δm—被吸附物质的质量；A—被吸附物所覆盖的面积。

石英压电传感技术是20世纪60年代初发展起来的一种新型测量技术，主要有体声波型和声表面波型两种形式[11]。由于应力、温度、电场、磁场、表面沉积物等外界因素均会对压电晶体的性能产生较大的影响，与此相对应，压电传感器有应力、角速度、加速度、温度、流量、电压等物理量传感器和湿度、气体、生物、电化学等化学量传感器。

1980年，Konash和 Bastiaans[12]首先实现了单面触液的压电晶体在液相中的成功起振。他们发现，石英晶体在液相中的频率偏移，不仅与电极表面所吸附的质量有关，而且与液体的密度有关。1991年，Martin等[13]推导出同时具有附着质量和液体阻尼情况的AT切型石英晶体谐振器频率偏移公式：

其中，Δfm是质量作用对响应的影响，ΔfL是Kanazawa和Gordon[14]所推导的晶体在液相中的振荡行为。姚守拙等[15]通过对多种溶液的响应的研究，提出了介电常数和电导两个参数对晶体振荡频率响应的作用，使液相压电传感经验方程式更趋完善。

体波式压电生物传感器主要由用生物识别物质包被的石英晶体、振荡器和频数计等几部分组成。AT方式切割的石英晶体，其振动频率按切割角度的不同有9、10、27 MHz等不同规格。体波式压电石英晶体，亦称为石英晶体微天平(quartz crystal microbalance,QCM)， 直径一般为 8～16 mm，厚度约为 0.1～0.3 mm，其两侧表面镀有直径为3～8 mm、厚度为1 μm左右的金（或银）膜形成激励电极，同时有利于修饰和固定识别元件。压电检测系统是由两个振荡回路、一个晶体检测振荡器、一个晶体参比振荡器组成，参比振荡器不包被生物识别物质，是为了校正温度、湿度、粘度和其它干扰因素的影响，消除一些误差。压电晶体的谐振频率及其改变由频率计数器测定，再经计算机进行数据分析和结果报告。

体波式压电生物传感器的选择性取决于吸附剂的性能，灵敏度取决于晶体的性质。一般来说，晶体质量增加对振动频率的改变约为50 Hz ng-1，频率计精度在0.1 Hz以下，理论上可允许检测10-12g级的痕量物质[16]。

声表面波（Surface Acoustic Wave）是沿媒质表面传播、振幅随深度迅速减弱的一种声波，早在一百多年前人们就从理论上认识了这种波的性质，但直到1965年激发表面波技术因为采用叉指换能器才有了技术上的突破。此后，表面波器件得到了迅速发展。现在已广泛应用于雷达、卫星、通讯、电子对抗和传感器技术等领域，成为一类有发展前途的新器件。

2 压电生物传感器的分类及应用

2.1 压电生物传感器的分类

根据检测环境不同，PEBS分为压电气相传感器和压电液相传感器[17～19]。同时，压电液相传感器分为质量响应型[18]和非质量响应型[19]。另外，PEBS可以和其它许多技术联用，其分类方式并不固定。一般可将其按以下几种方式分类[10]：根据所采用的生物识别元件分为压电免疫传感器、压电基因传感器、压电微生物传感器等；根据压电晶体信号转换方式分为体波式压电传感器、表面声波压电传感器、阻抗式压电传感器等；根据所联用其它技术及元件分为多参数同时检测压电传感器、流动注射压电生物传感器、电化学压电生物传感器、叠片式压电生物传感器等。在以上各种压电生物传感器中，研究和使用较多的是压电免疫传感器和压电基因传感器，有些工作在气相环境下进行分析检测，也有一些工作是在液相环境中进行分析检测[20～21]。

2.2 压电生物传感器的应用

在免疫分析方面应用,利用免疫反应而设计的压电免疫传感器作为一种新型生物传感器，是利用压电晶体对质量变化的敏感性,结合抗原抗体特异性结合的特点而形成的一种自动化分析检测系统，可对多种抗原或抗体进行实时快速、在线连续的定量测定及反应动力学研究，在医学检验、食品卫生监督、环境监测、工业、军事等领域有着广泛的应用前景。Minunni等[22]将人免疫缺陷病毒(HIV)某抗原表位的人工合成肽固定于石英晶体电极表面，实现了体液标本中的HIV抗体的检测。

在基因检测方面应用,Fawcett等[23]于1988年首先提出固定在石英晶体表面的DNA分子杂交后会引起共振频率的明显变化，在Fawcett工作的基础上，Okahata等[24]采用了一个9 MHz的AT切割的镀金的石英晶体，利用10个碱基能与单链的M13噬菌体DNA的EcoRⅠ结合位点互补的脱氧核糖核苷酸作为探针，研究了由于杂交引起的频率变化随时间的变化，获得了满意的结果。同时，还研究了不完全互补的靶DNA的杂交情况。

在其它分析检测方面应用,压电生物传感器作为一个实时监测的理想平台，除上述主要应用外，还可以有许多特殊的应用。Marx等[25]将压电传感器用于药物与细胞作用的研究，从而建立了一种压电细胞生物传感器 （QCM cellular biosensor）。Chuang等[26]把压电传感器与酶促反应相结合，研制了一种监测葡萄糖的压电酶传感器，固定尿素酶则制成了尿素分析压电传感器。

3 压电生物传感器信号放大技术

对压电生物传感器的信号进行增强放大，其目的在于改善传感器的性能，使其具有较高的灵敏度，较理想的特异性，稳定的重现性和较宽的响应范围。为此，研究人员采取了一系列措施从各个方面进行优化并加以改进，取得了较好的结果。常用的信号放大技术有以下几种：

3.1 基于表面修饰构建的信号放大技术

要构建一种性能良好的压电生物传感器，传感器的敏感识别部分（生物敏感膜）的固定是很重要的环节。要使生物识别分子保持固有性能的前提下处于不易脱落的状态，并能够在尽可能短的时间内响应，同时还应有足够的灵敏度和一定的可重复性。通常要求所采用的固定化方法既具有较高的固定量，又能使生物敏感膜的活性得以完好保持，还应减少背景非特异性吸附、易于传感界面的反复再生等。包埋法是用特定的膜将生物分子固定在压电晶振电极表面，获得生物敏感膜，该方法虽然简单易行，固定的生物分子的量比较大，但稳定性一般不高，对生物活性的影响也很大，在监测过程中蛋白质的非特异吸附较大，一般难以获得较高响应灵敏度和重现性。最初对PEBS的改善主要从构建一些性能优越的生物分子的固定界面着手展开研究，也一直是科研人员探索的主要目标之一[3,6]。

3.1.1 基于共价键合与交联固定方法

通过先压电晶体表面修饰带特定功能团（如-NH2、-OH、-COOH 等）的基质膜，再利用双功能试剂或多功能试剂（如戊二醛、甲苯二异氰酸酯等）交联固定生物分子的方法。常用的有聚乙烯亚胺(PEI)固定法、硅烷(APTES)固定法等。交联固定法由于操作简单，自从Shons等[17]首次用该方法制备了压电免疫传感器后，交联固定法被广泛用于免疫传感器中各种免疫物质的固定化[27]。

3.1.2 定向固定化技术

定向固定法指通过固定于换能器表面的其它分子作为桥梁，将生物组分固定在换能器表面[28～30]。常用的定向固定化方法主要有两种：一种利用蛋白A（或蛋白G）特异结合IgG类抗体Fc端的特性进行的定向固定化[29～30]；另一种利用自身带巯基的抗体IgG片段（或Fab'-SH）与金基体之间的吸附作用或与基体上修饰的特定基团键合作用进行的定向固定化[29～31]。

3.1.3 自组装单层膜固定法

自组装单层膜是近20年发展起来的一种新型有机超薄膜，是分子通过化学键相互作用自发吸附在固/液或气/固界面，形成热力学稳定和能量最低的有序膜[28]。吸附分子存在时，局部己形成的无序单层可以自我再生成更完善的有序体系。这种自组装膜所构建的生物传感界面，其物理化学性能显著优于传统的化学修饰电极。它结合了LB膜的分子有序性和化学吸附稳定性，具有均匀致密、缺陷少和生物相容性高等特性，具有良好的稳定性和化学性质。巯基自组装单层膜技术是一种备受青睐的成膜技术[31]，可根据需要制备带有其它不同功能团的单层膜，巯基丙酸、巯基乙醇等已被广泛地用于免疫分子固定载体膜[32]。

3.1.4 等离子体聚合膜沉积技术

等离子体聚合膜(PPF)是在等离子状态下聚合而成的一类有机复合膜，具有高度交联的网状结构和优良的物理化学性能。与传统聚合膜比较，此类膜的优势主要有[33]：（1）能实时控制膜的厚度，得到超薄膜（＜ 100 nm）；（2）均匀致密，无针孔；（3）具有良好的机械强度和化学稳定性；（4）与基质表面有极强的附着力，操作稳定性高；（5）大多数有机物包括一些常规下不能聚合的有机物均能制成PPF；（6）可在不同类型、不同形状的基质表面上聚合成膜。Nakanishi等[34]首次引进了PPF技术研制免疫传感器。他们以乙二胺PPF为载体膜，通过戊二醛交联白蛋白抗体，检测了血清白蛋白含量，并验证了在传感器稳定性与噪音水平方面，PPF明显优于传统聚合膜或硅烷化涂层。湖南大学的研究者在这方面也进行了大量的研究工作[35]。因此，PPF是一种很好的化学生物传感器的功能载体，已成为膜科学特别是传感器领域一个新的研究方向。

3.1.5 聚电解质静电吸附组装技术

聚电解质作为一种水溶性高分子化合物，在水溶液中以稳定的线性聚离子形式存在并带有大量同种电荷。天然聚电解质无毒无害,具有可生物降解性与生物相容性等优点。基于聚电解质是水溶性高分子以及静电自组装技术的优点,通过改变聚电解质种类和聚电解质溶液浓度、离子强度和温度等外界条件可实现膜厚在纳米范围内可调。聚电解质吸附组装技术是一类很有前景的超薄有机功能膜制备技术[36]，可交替吸附固定单层或多层蛋白质[37]，并在温和的条件下实现多种生物大分子在材料表面的固定,通过对组装条件的控制实现多种生物功能组装。

3.1.6 高支化聚合物的放大技术

高支化聚合物可分为两类：树枝状大分子和超支化聚合物。树枝状大分子是高度支化、具有树枝状三维空间结构的单分散大分子，这种大分子表面堆砌致密，内部有空隙，分子尺度在纳米级，其结构有着极好的几何对称性，通常有类似球形的结构，合成复杂，产率低。超支化聚合物同时具有树枝状大分子和线性聚合物的某些特点，单分子尺寸也是在纳米级，但支化度较树枝状大分子低，趋近于网状结构，一步反应合成，步骤简单。高支化聚合物具有良好的溶解性能，低的熔体粘度，高对称的结构并且末端带有大量官能团，因此已经被应用于化学传感界面来改变聚合物表面性质[38]。

3.2 基于纳米材料的信号放大技术

1990年7月，在美国巴尔的摩召开的第一届国际纳米科技会议标志着纳米科技（Nanoscience and Technology）的正式诞生。纳米材料是纳米科技的一个重要部分。由于在纳米尺度下物质中电子的量子力学性质和原子的相互作用将受到尺度大小的影响，因此纳米材料具有许多普通材料不可比拟的优良性能，也正因为如此，纳米材料的研制和应用一直成为人们关注的焦点[39]。纳米材料基本构筑单元包括纳米颗粒、纳米管、纳米线等。纳米颗粒是一种特殊的纳米材料，其本身具有规则的外形、均匀的尺寸和明显的尺度效应，并且纳米颗粒又可以直接作为纳米器件应用于生物医学的许多领域。纳米颗粒的尺寸与生物分子大小相近，并且纳米颗粒具有独特的电学、磁学和光学等性质。因此，结合了物理学、生物学与化学而发展起来的各种新型纳米颗粒，已经在生物样品的超灵敏检测、疾病的早期诊断、基因与药物的靶向输送、生物分离和生物医学成像等众多方面取得了骄人的成果[40]。

3.2.1 应用金纳米颗粒的信号放大

纳米金也称胶体金，它的形成是通过氯金酸（HAuCl4）在还原剂作用下，聚合成直径在1～100 nm之间的金颗粒，形成带负电的疏水胶体溶液。因为它是由静电作用而形成的稳定的胶体状态，故称为胶体金。由于纳米金颗粒具有独特的物理、化学性质及生物相容性。1971年Faulk和Taylor首次采用免疫金染色将纳米级胶体金应用于直接免疫组织化学检测沙门氏菌表面抗原[41]，这是纳米金颗粒应用于生物检测的里程碑。到1981年免疫金染色与银显染增强技术结合形成免疫金银染色后，纳米金颗粒得到了更为迅速的发展，已被广泛应用于生物学和医学等众多领域[42]。

3.2.2 磁性纳米粒子的信号放大

磁性纳米粒子是近年来发展起来的一种新型材料，因磁性纳米粒子具有特殊的磁导向性、超顺磁性，其表面可连接生化活性功能基团，使其在核酸分析、临床诊断、靶向药物、细胞分离和酶的固定化等领域已经开始了广泛的应用研究，基于磁性纳米粒子的蛋白质和DNA的生物传感器往往利用了磁性纳米粒子最为适合磁性富集和磁性分离的特点。Nam与Mirkin等报道了一种基于磁性纳米粒子的生物条码（Bio-Bar-Code）方法来检验DNA。在这一基础上，Nam等又将磁性纳米粒子扩展应用并实现了对蛋白质的检测[43]。

3.2.3 其它纳米粒子的信号放大

二氧化硅纳米粒子作为亲水型材料，比普通胶乳具有更高的密度、比表面积和物理化学稳定性，同时易于制备和进行功能化处理，从而用作生物活性物质的载体进行生化检测具有许多优势[44]。晋晓勇等[45]以纳米级SiO2颗粒替代传统胶乳标记羊抗人IgG抗体，根据压电免疫凝集传感原理建立了一种改进的液相压电免疫凝集技术，用于人IgG的直接、快速的检测。同时，考察了纳米金标记的一抗与人IgG的免疫凝集现象，并将其结果与SiO2纳米颗粒标记的一抗作比较。与常规免疫传感诊断方法相比，这种非质量效应型压电传感新技术具有快速、敏感、操作简单、成本低廉、装置体积小、便于携带、可直接进行连续检测等优点。

量子点纳米颗粒（QDs）又可称为半导体纳米微晶体，具有独特的光学性质。Chan等研究小组于1998年在Science杂志上同期报道了应用量子点荧光纳米颗粒标记生物分子，开拓了其在细胞生物学领域的研究[46～47]。

羟基磷灰石等纳米复合材料是继单组分材料、复合材料和梯度功能材料之后的第四代材料，具有特殊光学和电学性能。与单一组分的生物材料相比，复合生物材料的性能具有可调性。羟基磷灰石[HA：Ca10(PO4)6(OH)2]的化学组成和结晶结构类似于人骨骼系统中的磷灰石，作为新兴的生物医学材料，HA具有良好的生物相容性、生物活性[48]。

自从Iijima[49]在1991年发现了碳纳米管（CNT）后，全世界都掀起了一股研究碳纳米管的热潮。碳纳米管具有较好的导电性、优良的电子转移能力以及良好的化学稳定性等特点。现已有大量的研究报道用不同方法将碳纳米管固定到电极上来催化电活性物质的氧化还原反应。Zhang等将碳纳米管分散在壳聚糖溶液中然后固定到电极表面，利用碳纳米管的良好催化性能制备了葡萄糖传感器[50]。

3.3 酶催化信号放大技术

近年来，将酶催化放大技术用于压电传感技术也受到了人们的关注。为了提高检测灵敏度，Ebersole和Ward创立了酶催化质量放大压电免疫分析的方法。自此，各种各样的酶被用来催化底物生成不溶物沉积在电极表面来增加其质量负载，对其进行信号放大[51～52]。符婷等[53]提出了一种酶催化沉积放大的高灵敏压电免疫传感器，采用己二硫醇在晶振表面组装一单分子层，再结合纳米金颗粒，然后固定IgG抗体，在检测人IgG时，采用HRP酶标抗体夹心反应，通过酶催化底物DAB（3,3'-联苯二胺）生成沉淀到晶振表面达到放大信号的目的，取得较好的结果。

3.4 其它信号放大技术

生物素－亲合素系统是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统，随着各种生物素衍生物的问世，该体系很快被广泛应用于医学各领域。1979年Guesdon[54]利用生物素和亲合素间具有高度亲合力的特点，建立了标记亲合素和生物素法与桥联亲合素-生物素技术。亲合素由4个相同的亚基组成，能结合4个分子的生物素。亲合素与生物素之间的亲和力极强，二者结合的亲和常数(Ka)为1015mol-1，比抗原与抗体的亲和力(Ka：105-11mol-1)至少高1万倍，因此二者能快速结合，而且反应不受外界干扰，具有高度特异性和稳定性。目前亲和素已基本被链霉亲和素所代替。

在压电传感器方面，夏涵等[55]在所构建的压电石英晶体DNA传感器检测系统中引入该体系，使含有biotin-dUTP的表皮葡萄球菌靶DNA与HRP-链霉亲和素作用，建立基于辣根过氧化物酶催化的信号放大系统的压电DNA传感器微阵列，有效的提高了压电石英晶体传感器检测的灵敏度。

LB(Langmuir-Blodgett)膜技术是将具有脂肪疏水端和亲水基团的双亲分子溶于挥发性的有机溶剂中，铺展在平静的气－水界面上，待溶剂挥发后沿水面横相施加一定的表面压，这样溶质分子便在水平面上形成紧密排列的有序单分子膜。该技术可把液面上有序排列的一些有机化合物逐渐的转移到固定基片上，实现基片上的特定分子的高度有序排列。LB膜的特殊性使其制成具有特殊功能的生物传感器。因此，用它构建传感器界面时，其响应时间短且灵敏度高[56]。

脂质体是一种在水相中由磷脂双分子层定向排列而成的直径几纳米至几微米的超微囊胞。脂质体可以通过内部包埋或表面修饰等方法，成为多种功能团分子的通用载体。脂质体的内部水相可以包裹几乎任何标记物，脂质体表面可以通过各种物理或化学方法修饰官能团。被修饰了不同选择性的功能基团的脂质体已被广泛应用于免疫测定和DNA的检测。内部没有包埋信号分子，表面修饰了DNA或抗体的脂质体也可被用于信号放大作用[57～58]。

4 压电生物传感技术的改进与发展

近年来出现一些压电生物传感器与其它技术联用的报道。Harteveld等[59]将压电免疫传感器与流动注射技术相结合，使该传感器自动化程度进一步提高。Lu等[60]将压电免疫传感器与流动注射技术相结合，建立了一种有效可重复使用的免疫生物传感器。陈志敏等[61]介绍了近年来国际上将基因芯片技术与传感器技术结合的基因检测技术，评述了对光学、电化学和压电基因传感器及其应用的研究，并提出了基因传感器今后的研究方向和发展趋势。今后，压电生物传感器重点关注在以下几个方面的研究，将进一步提高其应用潜力：

（1）向市场化、商品化方向发展，实现仪器的便携性并开发廉价的石英晶振。目前对于压电石英晶体的研究还只停留在实验室阶段，所以当其研究日益完善、存在的问题逐步解决时，它将逐渐应用到工业中。

（2）与集成通讯和计算机联用，逐渐向智能化、自动化方向发展。

（3）随着生物电子技术、物理技术和微细加工技术的发展，向微型化、阵列化、便携式方向发展。

（4）向智能化、固态电子器件方向发展。

在PEBS的研发中，要结合不断出现的新工艺、新技术，如：微型机电系统技术、纳米技术等，并不断提高与完善、合理加以运用到压电免疫传感器检测工作中。开发出高通量、高敏感、阵列化、自动化、高集成度的“QCM传感器实验室”将是未来PEBS的发展方向。总之，集分子生物学、材料学、化学、电子学为一体的压电生物传感技术具有巨大的发展潜力，它不但有望作为新型的检测手段广泛使用于医学诊断、环境监测、食品卫生、军事等领域，并将在现代分析测量仪器中发挥越来越大的作用。

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