超声波法制备紫葡萄皮花色苷

章谷成,袁海娜,肖功年

花色苷(Anthocyanin)是一类水溶性色素,由花色苷配基(即花色素)和糖基以糖苷键结合形成。其中花色素是类黄酮化合物[1-3],属于多酚类物质。食品中常见的花色苷主要有:花翠素(飞燕草色素)、花青素(矢车菊素)、3′-甲花翠素(牵牛花色素)、甲基花青素(芍药色素)、二甲花翠素(锦葵色素)、天竺葵色素等种类[4-9]。据报道,花色苷具有降低肝脏及血清中脂肪含量、抗氧化、抗肿瘤、延缓血小板凝集等保健和药理作用[10],在食品、化妆品、医药领域有着巨大的应用潜力。

葡萄花色苷是一种天然食用色素,主要分布于葡萄的果皮、果肉、葡萄籽、芽鳞片等部位,果皮含量最高[3-4]。本实验采用超声波辅助萃取技术制备了紫葡萄皮花色苷(anthocyanin from purple grape skin,APGS),研究了APGS的色泽变化、光谱学性质和定量测定方法,并采用纸层析和薄层层析方法对APGS进行了初步组分检测,为APGS的应用开发提供了重要的实验和理论依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要仪器

UV-2102PC紫外可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司),CF15R HITACH冷冻离心机(天肯(上海)贸易有限公司),DHG-9023型全自动电脑干燥箱(杭州蓝天化验仪器厂),RE-52AA旋转蒸发仪器(上海亚容生化仪器厂),KQ3200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),AB 204-N电子天平(上海世义精密仪器有限公司)。

1.1.2 材料与试剂

原料:新鲜杭州产“巨峰”紫葡萄,购于杭州市留下菜市场,去除果肉,取葡萄皮。

主要试剂:无水乙醇、浓盐酸、醋酸、甲醇、蒸馏水、正丁醇、冰醋酸、盐酸、异丁醇、无水乙酸钠等,以上均为分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 APGS的制备

选取新鲜紫皮葡萄,去除果肉,准确称取鲜葡萄皮100 g,以预冷的70%乙醇匀浆,按固液比1∶7加入体积分数为70%的乙醇,并以1%盐酸调节料液pH值为3.5,采用超声波浸提30 min(超声波频率40 k Hz,功率150 W),浸提液于4℃离心,取上清液于(35±3)℃真空旋转蒸发,得APGS浸膏,冷藏备用。

1.2.2 APGS吸收光谱及最大吸收波长的确定

取一定量的APGS浸膏,经适当稀释,以70%乙醇为空白,检测其200～700 nm波长下的吸收图谱,并确定APGS在可见光区的最大吸收波长,记λmax。

1.2.3 APGS定量测定方法

采用p H示差法测定APGS的含量。取适量APGS浸膏,并以70%乙醇溶解,分别加入 pH 4.5 NaAc-HCl和p H 1.0 KCl-HCl的缓冲溶液,混匀。静置2 h后,分别测定不同p H值下APGS溶液在λmax和700 nm处的吸光值变化。

根据Fuleki[11]的研究,APGS的得率ω(mg/100g)和APGS的质量浓度C(mg/L)的计算方法如下:

式中:ΔA=(Aλmax-A700)p H1.0-(Aλmax-A700)pH4.5;V为花色苷溶液体积,mL;F为稀释倍数;av E1%1cm为平均消光系数,98.2[12];m为鲜葡萄皮质量,g。

1.2.4 APGS的分离

分别采用纸层析(PC)(层析滤纸为新华3号滤纸)和硅胶薄层层析(TLC)分离APGS。展开剂为m正丁醇∶m冰醋酸∶m水=4∶1∶5,观察层析斑点颜色变化,计算其Rf值。

2 结果与讨论

2.1 APGS的呈色反应

检测发现,APGS的色泽受p H值和一些化学物质的干扰和影响,结果见表1和表2。

表1 不同p H值对APGS的色泽影响Table 1 Effects of p H values on color of APGS

表2 不同化学物质与APGS的呈色反应Table 2 Color reactions of APGS with different chemical materials

由表1可见,随着pH值由小变大时,APGS颜色从橙色、红色、黄色到蓝色逐渐变化,此种颜色变化与文献报道的花色素变化规律相一致[13],初步说明APGS为花色苷类色素。同时,APGS色泽的呈现受pH值的影响较大,在一般食品p H值范围内多呈现黄色。而且食品中的某些化学物质或元素也影响花色苷的呈色状况,见表2。因此在添加了膨松剂(如小苏打、碳酸氢铵等)及强化镁、铁等元素的食品中,APGS的应用应考虑对其色泽变化的影响[14]。

2.2 APGS吸收光谱及最大吸收波长的检测

将适当质量浓度的APGS溶液进行紫外-可见吸收光谱检测,测定结果见图1。

从图1可知,APGS在紫外区存在238 nm和281 nm处的2个最大吸收波长,同时可见区也存在539 nm处的最大吸收波长。本实验所得APGS的紫外-可见区的光谱吸收情况与文献报道基本一致[13],说明APGS中含有花色苷类色素。

2.3 APGS的层析检测

为了进一步除去APGS浸膏中的极性杂质,向其中加入3～5倍体积的石油醚,反复沉淀后,以乙酸乙酯溶剂萃取3次,收集水相,并除去水相中残留的乙酸乙酯,得APGS水剂产品,冷藏备用。

APGS纸层析结果(图2)发现,层析纸上自上而下依次出现紫红色、桃红色和黄绿色斑点,且紫红色、红色斑点体积均大于黄绿色斑点体积,表明APGS中红色色素含量较大,而且由2种以上色素组成。将滤纸条移至紫外灯下观察,发现显红色的斑点无明显变化,而呈黄绿色的斑点呈现黄绿色荧光;将滤纸条再移至氨气瓶口观察,红色斑点呈现为黄色,而黄绿色斑点无明显变化。APGS水剂产品经纸层析后,自上而下依次出现紫红色和桃红色斑点,未出现黄绿色斑点。据文献[15]可推断,显红色斑点的色素属于花色苷类色素,黄色、黄绿色斑点则是类黄酮类色素,在APGS除杂质的过程中被除去。APGS水剂产品经过薄层层析分离后,硅胶薄层色谱板上出现了粉红色和紫红色斑点(图3),计算其Rf值分别为0.64和0.85。

纸层析和薄层层析结果均说明:以紫葡萄皮为原料,采用超声波提取技术所制得APGS中含有花色苷色素。但其品种不是单一的,进一步采用层析分离技术与质谱、核磁等分析手段,明确APGS中花色苷色素的组成,这是笔者今后对花色苷开发研究的方向之一。

2.4 APGS的定量测定

APGS在p H值1.0和pH值4.5时的吸光值结果见表3。

由1.2.3中公式计算得 ΔA=0.04,按照Fuleki[11]的pH值示差法测定APGS的得率和质量浓度分别为:

表3 不同p H值下APGS的吸光值Table3 Absorbance of APGS with different p H values

3 结 语

中国具有丰富的葡萄资源,而且葡萄饮料和酿酒工业中存在的大量葡萄皮残渣,均可制备花色苷色素。因此,葡萄花色苷具有良好的综合开发前景。考虑到紫葡萄的品种、产地、气候等因素所引起的花色苷分布的差异性,本实验中均采用了分布广泛的杭州产“巨峰”紫葡萄为原料,采用超声波辅助萃取制备了APGS。通过光谱学、纸层析和薄层层析分析,在APGS浸膏中初步发现了2种以上的呈红色花色苷色素。pH值示差法测得APGS中花色苷含量为145 mg/100 g。实验结果说明了超声波萃取技术应用于花色苷类色素制备的可行性。

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