大孔吸附树脂纯化紫花地丁中绿原酸类成分的研究

刘 娟,罗家函,刘德江,高 原,马珂佳

(佳木斯大学药学院,黑龙江 佳木斯 154007)

紫花地丁(Viola yedoensis Makino)为堇菜科堇菜属植物,又名光瓣堇菜、地丁草、独行虎等,全草入药,味微苦、辛,性寒 ,无毒,有清热解毒,抗炎消肿的功能[1]。紫花地丁主要抗炎成分为其所含的绿原酸和黄酮等,绿原酸[2]异名咖啡鞣酸,是植物在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类物质,为众多药材和中成药的抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分。大孔吸附树脂作为一种新型的吸附剂,鉴于其具有操作简便、可再生、分离纯化效果佳等许优点,近年来得到了广泛的应用[3]。本实验以紫花地丁中总绿原酸为指标,采用紫外-可见分光光度法,对8种大孔吸附树脂进行筛选,结果表明 H-107型大孔树脂对紫花地丁中的绿原酸类成分选择吸附性好,易于解析且纯化效果优良。

1 仪器与试药

757型紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。大孔吸附树脂:D-101(安徽三星树脂有限公司);S-8、AB-8、 H-107、 H-103(南 开大学 化工厂 );HPD100、HPD400、HPD600(河北沧州宝恩吸附材料有限公司)。

紫花地丁药材产于黑龙江佳木斯,经佳木斯大学药学院生药教研室刘娟教授鉴定,符合《中华人民共和国药典》2010年版一部标准。绿原酸标准品由天津一方科技有限公司购得。乙醇为 GR级。

2 方法与结果

2.1 总绿原酸的测定

2.1.1 标准品溶液的制备:精密称取5.10mg于105℃干燥至恒重的绿原酸标准品,加65%乙醇,配置成浓度为0.051mg/mL绿原酸标准溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备:精密称取紫花地丁干燥粉末1.00g,置于锥形瓶中加20mL 65%的乙醇,200W超声处理40min,过滤,滤液用65%的乙醇定容至100mL,备用。

2.1.3 紫外检测波长的选择:分别取标准品溶液与供试品溶液,在 200～ 800nm波长扫描。结果表明,对照品溶液与供试品溶液都在329nm波长处有最大吸收,所以选择329nm作为检测波长。

2.1.4 标准曲线的绘制:分别精密吸取浓度为0.051mg/mL的绿 原 酸标 准品 溶 液 0.00、 2.00、 4.00、 6.00、8.00、10.00mL于 25mL容量瓶中,以 65%乙醇定容,于329nm处测定吸光度,对所测得数据取平均值,以绿原酸浓度为横坐标 ,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,得出回归方程为 y=48.229x-0.0133(R2=0.9991)。

2.1.5 供试品含量测定:取供试品溶液,按紫外分光光度法操作,在329nm波长处测定吸光度,代入方程计算含量。

2.2 纯化用供试品溶液的制备

取适量活性炭对“2.1.2”制备的供试品溶液进行脱色,调节浓度为0.283mg/mL,备用。

2.3 树脂预处理

各型号大孔树脂分别以蒸馏水浸泡12h,饱和 NaCl溶液浸泡24h,4%NaOH溶液浸泡5h,去离子水洗至中性后,5%HCl溶液浸泡8h,再用去离子洗至中性,浸泡,待用。

2.4 大孔树脂的筛选

2.4.1 静态吸附:精密称取等量的8种型号大孔树脂置于50mL锥形瓶中,准确量取相同浓度的样品液20mL分别置入其中,将锥形瓶置于摇床上,室温条件下 ,以100rpm的速度间隔性振摇12h,静置12h,吸附达到平衡后,过滤,并用紫外分光光度计在329nm处测定滤液中残留的绿原酸含量,并按下列公式计算各型号大孔树脂的吸附率 E(%)。结果见表1。

2.4.2 静态解析:向已经吸附了紫花地丁绿原酸的8种型号大孔树脂所在的锥形瓶中加入65%的乙醇20mL,将锥形瓶置于摇床上,室温条件下,以100rpm的速度间隔性振摇12h,静置 12h,解析完全后,过滤,再用一定量的 65%乙醇冲洗各型号大孔树脂,合并滤液与冲洗液,并用紫外分光光度计在329nm处测定从大孔树脂上解析出来的绿原酸含量,并按下列公式计算各型号大孔树脂的解析率X(%)。结果见表1。

上述公式中:

Cα为吸附前紫花地丁溶液中所含绿原酸的浓度(mg/mL);Cβ为吸附后紫花地丁溶液中所含绿原酸的浓度(mg/mL);Cγ为解吸后紫花地丁溶液中所含绿原酸的浓度(mg/mL);Vα为吸附前紫花地丁溶液的体积 (mL);Vβ为吸附后紫花地丁溶液的体积(mL);Vγ为解吸后紫花地丁溶液的体积(mL)。

表1 8种大孔吸附树吸附率与解析率测定结果

2.5 动态吸附-洗脱试验

取适量的吸附率和解吸率都较高的 H-107型大孔吸树脂,湿法上柱后,以样品浓度为0.283mg/mL,调节 pH=3.5,以3mL/min的速度上样,以3.5倍柱体积65%乙醇,调节洗脱流速至3mL/min进行洗脱,收集洗脱液,测定滤液中绿原酸含量,水浴蒸干后测定总固体质量,并计算纯化后所得紫花地丁绿原酸粗品含量 W(%),测得X=38.61%。

W(紫花地丁粗品含量)=CV/M×100%

式中:C为洗脱液中紫花地丁绿原酸的浓度;V为洗脱液的体积;M为洗脱液经旋干后所得固形物的质量。

3 讨论

虽然 S-8型大孔树脂在静态吸附下的吸附率最高,但其解吸率较低。H-107型大孔树脂在静态吸附下具有较高的吸附率为74.71%,并且易于解吸,其解析率为 95.91%。这是因为绿原酸是一种含有酚羟基的多酚类化合物,属于极性分子,易与孔容和比表面积较大的 H-107型大孔树脂形成氢键,因此吸附效果较好;又因其孔径适中,因此解吸率较高。综合考虑,选用 H-107型大孔树脂最适合于紫花地丁中绿原酸类成分的纯化,所得紫花地丁绿原酸纯度较高。

[1] 任仁安.中药鉴定学 [M].上海:上海科技出版社,1986,466

[2] 李定刚,张武岗.紫花地丁抗菌活性成分 [J].西北农林科技大学学报(自然科版),2006,34(4):87-90

[3] Mi J Y,Song C Q.Advances of application of macroporous resin study of traditional Chinese herbs[J].Chin Tradit Pat Med(中成药),2001,23(12):914-917