冬虫夏草含药血清诱导神经干细胞分化的研究

郑衍芳,李艳君,赵 勇,李啸红,黄昕燕,王志群

(1.遵义医学院珠海校区人体解剖与组织胚胎学教研室,广东珠海 519041;2.佳木斯大学医学院,黑龙江 佳木斯 154007)

N SCs是神经系统发育过程中特殊的细胞群,是能够在适当的微环境中分化产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的一类多能干细胞。近年来,一些研究表明移植神经干细胞治疗急、慢性脊髓损伤以及多种神经系统疾病具有广阔的临床应用前景。本实验就冬虫夏草在促进神经细胞向神经元方向分化的作用进行了初步的探索。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

体外培养神经干细胞所用动物新生24h内的 Wistar大鼠,灌胃取血清体重平均为200g的 Wistar大鼠均为佳木斯大学动物实验中心提供。冬虫夏草菌丝体购自杭州中美华东制药有限公司。

1.2 冬虫夏草含药血清的制备

随机选取体重约200g的 Wistar大鼠分四组,每组 8只,适应性喂养7d后,分别给予冬虫夏草水提液 0.5g/kg˙d,0.75g/kg˙d,1g/kg˙d分两次灌胃,对照组予以等量的生理盐水灌胃。灌胃14d,第14天早灌胃1h后,将大鼠进行乙醚麻醉后,行内眦采血,分离血清 ,56℃水浴30min灭活 ,放-20℃冰箱冻存备用。

1.3 N SC的分离培养与传代

(1)N SCs的原代培养:取新生 Wistar大鼠两只在无菌条件下断头取脑,用弯头镊子取海马组织,放入盛 Hank's液的培养皿,漂洗三次后,剪成大小约1mm3组织块,加入胰酶消化成乳糜状,10%胎牛血清0.5mL终止消化,200目过滤网过滤,取过滤液离心,弃上清液 ,加入适量完全培养液,用抛光的长颈吸管吹打成单细胞悬液 ,调整细胞为1× 105个 /mL,接种到含 EGF,bFGF,B27的 DMEM/F12培养基的培养瓶中,放入37°、5%CO2、湿度80%的 CO2培养箱中培养,每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况 ,每3d半量换液一次,7d左右进行细胞传代培养。

(2)NSCs的传代培养:原代培养7d后,低倍镜下观察,细胞铺瓶率达到80%～ 90%,克隆球直径约为200μm时进行分瓶传代。在无菌操作下用抛光的长颈吸管将克隆球连同培养液一同移入离心管,放入离心机中以1000r/min的转速离心5min,弃上清液,机械分离神经球为单细胞悬液,在倒置显微镜下计数台盼蓝染色后活细胞比例后,以5× 105个 /mL的密度分装,传代培养,每隔3d半量换液1次,隔7d传代1次。

1.4 N SC的 Nestin鉴定

NSCs的 Nestin鉴定传代三次后的神经球接种到含DMEM/F12培养基的24孔板上(板上涂布 0.01%多聚赖氨酸),24h内行 Nestin细胞免疫组化检测。

1.5 N SC的诱导分化

将传三代后的神经干细胞球分4组,每组8孔,以细胞为1× 105个 /mL的密度接种在赖氨酸包被的24孔板上 ,实验组用 DMEM/F12培养液加10%低,中,高剂量的药物血清,对照组用 DMEM/F12培养液加10%的鼠血清在37℃、5%CO2、80%的 CO2培养箱中培养。每隔3d半量换液,每天观察细胞生长情况,培养7d进行 N SE、GFAP免疫细胞化学染色。

1.6 免疫组化

对药物诱导7d的神经干细胞分别进行免疫细胞化学染色法 ,一抗 (Nestin1:400;NSE1:200;GFAP1:200)。NSE免疫细胞化学中,每孔盖玻片随机选取 10个不重叠视野,在100倍镜下计数单位视野阳性细胞数通过计数阳性细胞率检测神经干细胞向神经元分化情况。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1细胞培养观察原代培养2h单细胞均匀悬浮在培养液中(图1),7d可见肉眼可见较多的神经球聚集,液体透明。镜下观察,神经球比较多,背景干净,球散在培养液中,球中央至外周均透明,折光度好,边界清晰 (图2)。

2.2 神经干细胞 Nestion免疫染色观察

经免疫细胞化学染色,神经干细胞标记性蛋白 Nestin在原代及传代培养的神经球均有表达(图3),胞浆及突起呈黄褐色。将贴壁的神经球培养一周后,对分化的神经样细胞分别进行 NSE(图 4),GFAP(图5)免疫组化,鉴定结果显示阳性,神经元胞体近椭圆形,核较大、呈圆形 ,有一较长的突起,胶质细胞胞体多呈多角形或长梭形,核小 ,突起较多而短。从而验证了培养的神经干细胞有增值分裂的特性。

2.3 冬虫夏草含药血清诱导 NSCs增殖分化的检测结果

冬虫夏草含药血清添加到三代后的神经干细胞进行培养,24h内开始贴壁,克隆球的周缘开始有伪足形成,3d后突触交织,神经样细胞移出神经球,7d后,神经元细胞胞体逐渐增大,饱满,突触增长,神经元细胞分散移出 ,胞体饱满 ,折光性好,突触增长变粗 (NSE图 6～ 9)。免疫组化显示分化后NSE阳性细胞,与对照组相比冬虫夏草含药血清低,中浓度组分化 N SE细胞较多 (P＜0.01),而高浓度组细胞无明显差异 (P＞ 0.05)。

表1 各实验组诱导神经干细胞7d后神经元胞体周长及面积的测量 ±s,n=10)

表1 各实验组诱导神经干细胞7d后神经元胞体周长及面积的测量 ±s,n=10)

a:P＜0.01;:bP＜0.01;c:P＞ 0.05。

组别 周长(um) 面积(um2)对照组 114.50± 6.79151.15± 18.82低浓度药物血清组 145.71±5.17a 248.10±29.26a中浓度药物血清组 142.23±6.54b 239.19±26.23b高浓度药物血清组 118.91±6.54c 167.63±16.74c

3 讨论

N SCs的特异性标志抗原是神经巢蛋白,或称神经上皮干细胞蛋白(Nestin),该基因在未分化的神经系统中表达,分化后成熟的神经细胞不表达,因而是 NSCs的特异性标志物.研究的原代、传代培养细胞,Nestin免疫组化呈阳性反应,具有神经干细胞的这一特征。神经干细胞最突出的两个特点是具有自我更新能力,可通过不对称细胞分裂产生新的细胞。本实验利用 BrdU(溴脱氧尿苷),单抗标记技术,阳性表达细胞为 S期细胞或分裂增殖产生的新生细胞,表明本实验分离培养的细胞群具有分裂增殖,自我更新的能力。动物灌服中药后,提取血清用于体外实验是日本学者 Hiriko Iwama首先提出的[1]。该方法更接近于体内实验。一些研究[2～4]表明:NSCs自然分化为神经元的比例非常低。本实验各试验组促进神经干细胞分化为神经元的数量均高于对照组,且神经元样细胞的面积、周长均大于对照组,这无疑是冬虫夏草水溶液发挥的药理作用。冬虫夏草含有18种氨基酸,其中包括谷氨酸,甘氨酸,作为微环境中的一员也参与对神经干细胞分化的调节。从冬虫夏草中分得腺嘌呤、腺苷、胸腺嘧啶、尿嘧啶、尿苷、脱氧腺苷和虫草素(3'-去氧腺嘌呤核苷)等核苷类成分 ,尤以腺苷具有明显的药理作用[5]。可以调节腺苷酸环化酶活性。促进胞内 cAM P的增加,从而激活cAMP介导的信号转导途径,进而引起细胞的分化。实验证明[6～8]各种糖蛋白、黏蛋白组成通过调节黏着和迁移能力,以及与细胞外基质中各种生长因子和细胞因子的结合,来影响 NSCs的增殖和分化。虫草中的虫草素和 D-甘露醇可以清除自由基[9],起到抗氧化的作用。近年的一系列研究表明,细胞内 ROS水平的轻微增高促进 NSCs的增殖和分化,而胞内 ROS水平的显著增高则快速触发 NSCS的凋亡。由此推断,冬虫夏草能通过上述几个方面促进神经干细胞向神经元方向分化,并对所分化的神经元样细胞有良好的促发育作用。由于血清成分复杂,冬虫夏草的确切机制还有待进一步研究,但我们利用冬虫夏草分化出较多的神经元细胞,这一结果为冬虫夏草治疗神经系统损伤性疾病提供了实验依据,为临床应用打下了理论基础。

[1] Santa-Olalla J,Covarrubias L.Bacic fibrobiast growth factor promots epidermal growth factor responsiveness and survival of mesencephalic neural precursor cells[J].Neurobio1,1999,40(1):14-21

[2] Yan丫,Yang D,Zarnowska ED,et al.Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells[J].J Stem Cells,2005;23(6):781-790

[3] 张晓梅,金玉玲,朱晓峰.体外培养海马神经干细胞分化前后离子通道检测 [J].黑龙江医药科学,2005,28(1):4-5

[4] 徐忠烨,朱晓峰.新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及鉴定[J].黑龙江医药科学,2005,28(1):2-4

[5] 李绍平,李萍,季晖,等.天然与发酵培养冬虫夏草中核苷类成分的含量及其变化[J].药学学报,2001,36(6):436

[6] Plup M,core R,Morali OG,et al.Cadherinsin neural crest cell development and transformation[J].Cell Physip,2001,1989(2):121-132

[7] 张晓梅,徐忠烨,朱晓峰.bFGF、EGF联合应用对新生大鼠海马神经干细胞分化的影响 [J].黑龙江医药科学,2002,25(5):4-6

[8] 金玉玲,张晓梅,朱晓峰.移植神经干细胞在脑缺血大鼠损伤脑区的定向分化及其对运动功能的影响 [J].黑龙江医药科学,2005,28(1):1-3

[9] 张小强,浦跃朴,尹立红.冬虫夏草及人工虫草菌丝体对超氧阴离子自由基和羚自由基清除作用的实验研究[J].中国老年学杂志,2003,23(11):773