HPLCELSD法测定硫酸西索米星有关物质的研究*

刘海玲，曹晓云

(天津市药品检验所，天津 300070)

硫酸西索米星是由小单孢菌所产生的一种氨基糖苷类抗生素，由于氨基糖苷类抗生素无特征紫外吸收，不能直接采用传统HPLC-UV法测定，采用衍生化方法测定试验结果影响因素多，无法明确判断检测到的杂质来源，限制了衍生化法在氨基糖苷类抗生素有关物质检测方面的应用。蒸发光散射检测器(ELSD)为不含发色团化合物的分析提供了一种新的检测手段，其响应值与被测物质量成正比，不依赖于被测物质的光学性质[1]。近年来陆续有文献报道用蒸发光散射检测器进行氨基糖苷类抗生素的质量分析[2-5]。《日局方》第15改正版采用TLC法检查硫酸西索米星有关物质，其余各国药典均未制定硫酸西索米星有关物质检查项。本实验采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法[6]对硫酸西索米星进行有关物质检查，方法灵敏度高、重现性和准确度好，可满足质量控制要求。

1 仪器与试药

岛津LC-10AT高效液相色谱仪，Alltech ELSD 2000ES型蒸发光散射检测器。西索米星标准品(中国药品生物制品检定所提供，批号0353-200001)；硫酸西索米星为江苏无锡山禾福祁制药有限公司(批号20070801、20071001和20071002)和江苏无锡第二制药厂(批号20070503)提供。试验用水为娃哈哈饮用纯净水；三氟乙酸为TEDIA公司产品。

2 方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性 色谱柱：CAPCELL PAK TYPE：ACR C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：0.3 mol/L三氟乙酸-甲醇-乙腈(96∶3∶1)；流速：0.5 ml/min；蒸发光散射检测器，漂移管温度：110 ℃，雾化气体流速：3.0 L/min。

系统适用性试验：分别称取庆大霉素C1a和西索米星对照品适量，用水溶解并稀释制成每1 ml中含庆大霉素C1a0.1 mg和西索米星3 mg的溶液，作为分离度测试溶液①；称取西索米星对照品约50 mg，加0.5 ml过氧化氢溶液(浓过氧化氢溶液10→100)溶解，水浴45 min后立即取出，放冷至室温，加水稀释至10 ml，摇匀，作为分离度测试溶液②。分别精密量取分离度测试溶液①和②各20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。西索米星峰与庆大霉素C1a峰的分离度为1.2；在相对保留时间0.80～0.95处应能检测出三个氧化降解物。见图1。

2.2溶液制备

2.2.1供试品溶液 取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1 ml中约含西索米星3 mg的溶液，作为供试品溶液。

2.2.2自身对照溶液 精密量取供试品溶液适量，加水稀释制成每1 ml中约含西索米星15、30和120 μg的溶液，作为自身对照溶液①、②和③。

2.3破坏试验 取硫酸西索米星适量，进行①酸(50%三氟乙酸溶液1 ml,水浴5 min)、②碱(浓氨溶液0.5 ml,水浴1 h)、③氧化(10%过氧化氢溶液0.5 ml，水浴45 min)，分别用水稀释制成每1 ml中含3 mg的溶液，④热(水溶液，水浴1 h)和⑤紫外光(254 nm)(水溶液，照射24 h)破坏，进样测定，色谱图见图2。各破坏条件下，降解产物峰均能与西索米星峰良好分离。破坏试验表明，本法可有效检出分解产物。

1.西索米星 2.庆大霉素C1a 3.三个氧化降解物

2.4稳定性试验 取供试品溶液室温分别放置0、4和8 h时测定有关物质，结果表明硫酸西索米星供试品溶液室温下放置8 h内基本稳定，总杂质分别为3.32%、3.30%和3.28%，最大单一杂质分别为2.01%、2.02%和2.01%。

2.5线性试验和最低检出量 取西索米星对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1 ml中约含西索米星1 mg的溶液，精密量取此溶液0.75、1.5、3.0、6.0和12.0 ml，分别置5个100 ml量瓶中，均加水稀释至刻度，摇匀。分别精密量取各溶液20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。硫酸西索米星进样量(以西索米星计算)在0.15～2.38 μg范围内，峰面积对数(Y)与进样量对数(X)线性相关：Y=1.725 0X+5.954 2(r=0.999 8)。以信噪比3为限，在此色谱条件下，西索米星有关物质检查最低检出量为57 ng。

1.西索米星

2.6有关物质的测定 按照“2.2”项下的方法制备供试品及自身对照溶液，在“2.1”项下色谱条件下，精密量取供试品溶液与对照溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。以自身对照溶液浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算回归方程，用回归方程计算单个杂质和总杂质的含量。结果见表1。

表1 样品测定结果

3 讨论

3.1流动相的选择 氨基糖苷类抗生素极性较大，在ODS柱上不保留，可通过与挥发性酸形成离子对或采用碱性流动相使氨基糖苷类抗生素游离成碱，降低极性以增加在色谱柱上的保留[3]。

采用碱性条件[4]，试验了乙酸胺系统，试验结果表明，流动相为碱性时，杂质峰分离度不好，西索米星色谱峰峰形不对称。

采用酸性条件，试验了五氟丙酸系统[5]，试验结果表明，随着五氟丙酸浓度的增大，主峰前的杂质峰与主峰的分离度变大，但出峰时间较晚，主峰峰形不对称。试验了三氟乙酸流动相系统[3]，随着流动相中三氟乙酸浓度的增加，西索米星色谱峰的保留时间减少，峰形改善，检出杂质也相应的增加。在流动相中添加丙酮和四氢呋喃，杂质峰均未分离；添加乙腈和甲醇，各杂质峰的分离较好。将流动相中的有机相改为甲醇和乙腈的混合溶液，保证了色谱峰的峰形和分离度，增加了流动相中有机相的比例，结果较为满意。因此选择三氟乙酸作为流动相的离子对试剂对西索米星进行分析。

3.2蒸发光散射检测器条件的选择 考察漂移管温度分别为80、100、105、110和115 ℃时的分析情况，试验结果表明，漂移管的温度对检测结果影响不显著。分别考察载气流速为2.0、2.5 、3.0 和3.5 L/min 时的分析情况，试验结果表明随着载气流速的减小，峰面积增大，基线则越不稳定。综合试验结果，确定漂移管温度为110 ℃，载气流速为3.0 L/min。

3.3本试验中根据保留时间一致，暂称西索米星主峰后紧邻的杂质为庆大霉素C1a，并未进行其他确证试验。

3.4色谱柱的粗放度 采用Diamonsil C18100 A(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和CAPCELL PAK TYPE:ACR C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色谱柱不同时间测定20070503批样品，结果见表2。结果表明，检测结果基本一致。

表2 采用不同色谱柱测定结果的比较

本方法采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测，样品不需要衍生化，可避免测定过程引入新的杂质，提高了分析精度，相较于传统薄层色谱法有更高的灵敏度及准确性，可以提高产品的质控水平，增加药品使用安全性。

1 陈冠华，潘淑萍，胡江宁.硫酸阿米卡星含量及有关物质的HPLC-ELSD测定.中国医药工业杂志，2005，36(3)：171

2 吴燕，张胜强，郭成明，等.HPLC-ELSD法分析硫酸奈替米星与硫酸西索米星的含量和有关物质.中国药品标准，2004，5(4)：35

3 王建, 王知坚, 陈贵斌, 等.HPLC-ELSD和HPLC-MSn分析硫酸西索米星及其注射液.中国药学杂志，2007，42(1): 62

4 Wang Mingjuan, Hu Changqin.Analysis of spectinomycin by HPLC with evaporative light-scattering detection.Chromatographia,2006,63(5/6):255

5 Megoulas N C,Koupparis M A.Development and validation of novel HPLC/ELSD method for the direct determination of tobramycin in pharmaceuticals,plasma,and urine.Anal Bioanal Chem,2005,382(2):290

6 刘海玲，曹晓云. HPLC-ELSD法测定硫酸西索米星的含量.天津药学，2011，23(4)：3