不同地域和季节蚕沙中 DNJ含量差异性的研究*

朱旭东，毛雪冬，郑斯齐，董襄朝，朱元元

(1.南开大学化学院，天津 300071； 2.南开大学药学院和天津市分子药物研究重点实验室，天津 300071)

现代研究表明，1-脱氧野尻霉素(DNJ)可以明显抑制食后血糖急剧升高的现象，延缓糖尿病的发作和恶化，对肥胖症、病毒性感染等疾病具有显著疗效[1]。桑科桑属植物的叶子、皮以及蚕沙中1-脱氧野尻霉素的含量较高,是临床常用的中药材，具有明显的降糖作用。蚕沙作为一种养蚕业的副产物，来源广泛，资源利用度低，目前主要用做肥料。若从其中提取DNJ成分，并制成各种降血糖中成药及功能食品，其应用前景十分广阔[2]。

1 仪器和试药

1.1仪器 SHIMADZU系列高效液相色谱仪，LC-6AD泵，CBM-20A控制器，RID-10A检测器；DIONEX荧光检测器；岛津LCsolution工作站；KQ3200型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ALB-224电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；TGL-16G型高速台式离心机(上海医用分析仪器厂)；LGJ-0.5冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂)。

1.2试药 生药样品(蚕沙及桑叶)；盐酸1-脱氧野尻霉素对照品(Sigma提供)；9-芴甲氧羰酰氯(Sigma提供)；色谱纯乙腈(美国Tedia)；水为娃哈哈纯净水；硼酸、氢氧化钾、盐酸、甘氨酸、冰醋酸均为分析纯。

2 方法和结果

2.1色谱条件 色谱柱：YMC-Pack ODS-A色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%冰醋酸(40∶60)；流速：1.0 ml/min；荧光激发光波长为254 nm，检测波长：322 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μl。

分别吸取对照品溶液、空白溶液和样品溶液各20 μl，在上述色谱条件下进样，即得到DNJ的测定液相色谱图，见图1。从图1中可以看出，样品中的DNJ与相邻组分均得到良好的分离。衍生试剂的水解副产物FMOC-OH和Gly-FMOC均不干扰组分的测定。

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液 精确称量在-50 ℃冷冻干燥14 h的盐酸DNJ对照品适量，加0.05 mol/L盐酸制成30 μg/ml左右的溶液，冷藏备用。

2.2.2样品溶液 取蚕沙适量，研细，取约1 g，精确称量，置50 ml离心管中，精密加入0.05 mol/L盐酸25 ml。超声处理20 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液，沉淀再加入0.05 mol/L盐酸25 ml，超声处理20 min[3,4]。合并2次提取液，摇匀，静置片刻，取上清液适量，3 000 r/min离心2 min，即得。

2.2.3衍生溶液 分别精密吸取对照品溶液或样品溶液各200 μl置2 ml量瓶中，分别精密加入0.4 mol/L K3BO3缓冲液(pH 8.5)200 μl，摇匀，加入5 mmol/L FMOC-Cl的乙腈溶液1 000 μl，摇匀，在20 ℃衍生30 min，加入0.05 mol/L的甘氨酸溶液500 μl，以0.1%冰醋酸定容至刻度，摇匀，以12 000 r/min离心10 min，即得。

2.2.4空白溶液 依“2.2.3”项下方法，以蒸馏水200 μl代替对照品溶液，即得空白溶液。

2.3线性试验 取盐酸DNJ对照品适量加0.05 mol/L盐酸制成0.08 mg/ml的对照品溶液，分别精密吸取上述对照品溶液1、2、4、6和8 ml，置10 ml量瓶中，加0.05 mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，按“2.2.3”项下的方法分别制备衍生溶液，进样20 μl，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作标准曲线，得回归方程为Y=-6 786.95+41 822 922.26X(r=0.999 9)。结果表明，盐酸1-脱氧野尻霉素对照品浓度在0.008～0.08 mg/ml范围内线性关系良好。

1.DNJ

2.4精密度试验 取同一份样品溶液，连续重复进样6次，每次进样20 μl，结果平均峰面积为931 154，RSD为1.66%，表明精密度良好。

2.5稳定性试验 取样品溶液，分别在0、3、6、9和12 h进样，进行稳定性试验，结果平均峰面积为913 392，RSD为1.89%，测定结果表明，在12 h之内色谱峰面积无明显改变，稳定性良好。

2.6重现性试验 精密称取同一样品约1 g，平行称取6份，按上述方法检测，每次进样量为20 μl，测定含量，结果盐酸DNJ的平均含量为1.13‰，RSD为1.70%。

2.7回收率试验 精密称取盐酸DNJ对照品适量置250 ml量瓶中，加0.05 mol/L盐酸配制成0.03 mg/ml的溶液，摇匀，作为对照品储备溶液。精密称取已测定含量的样品0.75 g，加入对照品储备溶液25 ml作为第一次提取液，第二次提取按“2.2.2”项下方法进行，加入0.05 mol/L盐酸25 ml，合并两次提取液，按“2.2.3”项下方法制成样品衍生溶液，每次进样量为20 μl。计算含量和回收率，结果平均回收率为99.6%，RSD为2.94%，符合要求，见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.8各地不同时间采集样品(蚕沙、对应桑叶)中DNJ含量分析

2.8.1同地区同时间桑叶与对应蚕沙DNJ含量对比 桑叶中 DNJ含量明显高于蚕沙，说明蚕在摄食桑叶的过程中对DNJ没有明显的富集作用，见表2。

表2 同地区同时间桑叶与对应蚕沙DNJ含量

2.8.2同时间不同地区蚕沙中DNJ含量对比 虽然采集时间相同，但是蚕沙中DNJ含量与采集地点有很大关系，其中广西南宁蚕沙中DNJ含量最高，江苏次之，四川、河北、陕西等地较低，见表3。

表3 同时间不同地区蚕沙中DNJ含量

2.8.3同地区不同时间蚕沙中DNJ含量对比 虽然采集地点相同，但是蚕沙中DNJ的含量随时间的不同有很大的差异，各地均是秋季蚕沙中DNJ含量明显高于春季，见表4。

表4 同地区不同时间蚕沙中DNJ含量

2.8.4同地区、同时间不同品种桑树喂养得蚕沙中DNJ含量对比 同时同地采集的蚕沙中，由于喂养的桑叶品种差异而导致的蚕沙中DNJ含量差异性不是很明显，见表5。

表 5 同地区同时间不同品种桑树喂养得蚕沙中DNJ含量

3 讨论

实验过程中发现，蚕沙快速水洗基本不影响DNJ含量(差异约为2%)。但是发霉变质会引起很大的差异，约为60%以上，且DNJ含量越高差异越大，说明中药材贮藏方法的重要性。

在已有的数据中，江苏省吴江市蚕沙与对应桑叶的DNJ含量差异最小。各地采集的样品(桑叶和蚕沙)中，DNJ含量均是秋季明显高于春季。

本试验通过对蚕沙中DNJ的提取方法、色谱条件、衍生化反应以及方法的准确度、灵敏度、加样回收率等环节的优化，建立了FMOC-Cl柱前荧光衍生-高效液相色谱法测定蚕沙中1-脱氧野尻霉素的方法，该法简便、准确、重现性好，可以推广为桑叶及其相关产品中DNJ的一般分析方法。

1 苏海涯，吴跃明，刘建新. 桑叶中的营养物质和生物活性物质.饲料研究，2001，1(9):1

2 赵丽君，齐凤兰，瞿晓华，等. 桑叶的营养保健作用及综合利用.中国食物与营养，2004，1(2):22

3 花俊丽，刘树兴，陈素绢. 超声波法提取1-脱氧野尻霉素.食品与生物技术学报，2009，28(6):845

4 刘韦鋆，赵俊，高秀梅，等.1-脱氧野尻霉素提取精致工艺的研究.中华中医药学刊，2009，27 (10):2079