慢性乙醇中毒小鼠海马Caspase-3的表达

亢 勤

河南省建筑医院内科郑州450001

慢性乙醇中毒性痴呆是长期大量饮酒引起躯体与精神记忆障碍相关的一类疾病［1-2］。文献［3］报道，酒精接触能显著抑制与记忆力、认知相关的脑细胞的增殖，降低细胞存活率，诱导脑细胞变性、萎缩，进而出现一系列精神症状。作者建立慢性乙醇中毒模型小鼠，利用水迷宫实验观察其学习记忆功能的变化，免疫组织化学和免疫印迹法检测脑组织凋亡相关蛋白Caspase-3表达的改变，探讨慢性乙醇中毒引起脑功能退化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 ①主要试剂:兔抗鼠激活型Caspase-3多抗购自美国Promega公司;Caspase-3 antibody购自Santa Cruz公司;FITC标记羊抗兔IgG购自北方同正生物科技有限公司。无水乙醇等其他试剂除特别注明外均为国产分析纯。②实验小鼠:c57BL/6小鼠由河南省实验动物中心提供，体质量20～30 g，雌、雄各半。单笼饲养，室温控制在20～25℃，相对湿度60%～70%，定期更换垫料消毒。采光控制为8 h光照，16 h黑暗。自由进食水，食物为河南省实验动物中心提供的小鼠标准饲料，饮用水选用实验室自制单蒸水。

1.2 实验分组 小鼠随机分3组，即正常对照组、低剂量组和高剂量组，每组6只，雌雄各3只。高、低剂量组参照目前国内通用的灌胃方式［4-5］制备慢性乙醇中毒模型:小鼠自由饮食，每日9:00禁食、水，2 h后，低剂量组灌胃无水乙醇2.4 mL/d，高剂量组灌胃无水乙醇4.8 mL/d。正常对照组灌入等量的生理盐水。灌胃后恢复正常饲养。每组小鼠饲养期间每日16:00观察行为学表现。

1.3 观测指标

1.3.1 行为学观察 采用Morris水迷宫实验测定。水迷宫由圆形水池和自动录像及分析系统两部分组成。平台位于水下2 cm，将每只动物头部染黑，于象限边1/2弧度处将动物头朝池壁入水，180 s未找到站台者，将其引至站台，第1～2天为训练，后3天正确到达安全岛时间作为学习和记忆成绩。以小鼠到达安全岛的时间判断学习记忆功能是否障碍［6-7］。

1.3.2 小鼠海马激活型Caspase-3检测 按照水迷宫实验标准［6-7］，实验小鼠出现学习记忆功能障碍2周后即行检测。每组随机取3只小鼠，断头取脑，多聚甲醛4℃固定48 h。PBS缓冲液冲洗，取海马40 g/L琼脂糖包埋，震荡切片机(Nature Gene Co，美国产)切片。切片经0.1 mol/L PBS漂洗。然后加入一抗兔抗鼠激活型Caspase-3(按500倍稀释)，置4℃冰箱中孵育过夜，PBS漂洗干净后加入二抗，室温下避光孵育1 h，然后用PBS漂洗3次。5 mg/L DAPI染色2 min，封片。阳性细胞胞质或胞核棕色着色。每张切片随机选择9个高倍视野，每个视野计数100个细胞中的阳性细胞数，计算阳性细胞百分比。

1.3.3 小鼠海马Caspase-3蛋白检测 取各组剩余小鼠海马组织适量，冷PBS洗涤2次，用总细胞蛋白裂解液200 μL，液氮下研磨，剧烈振荡，充分裂解，冰浴30 min，4℃12 000 r/min离心15 min。考马斯亮蓝G-250法测样品蛋白并均衡蛋白浓度。经电泳、切胶、转膜，封闭后Western blotting检测，ECL化学发光法显示结果，压片曝光。以β-actin作内参照。图像用Image J软件进行灰度扫描，以Caspase-3与β-actin条带光密度比值表示Caspase-3的相对表达量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 11.0进行分析，3组间Caspase-3蛋白表达的比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 行为学观察结果 对照组观察期内未出现学习记忆功能障碍，高剂量组在(14±2)d后即出现学习记忆功能障碍，而低剂量组在(28±3)d后也出现不同程度的学习记忆功能障碍，高剂量组障碍出现时间早于低剂量组(t=9.511，P ＜0.001)。

2.2 海马激活型Caspase-3的表达 见表1。高剂量组海马激活型Caspase-3阳性表达率高于低剂量组，低剂量组高于对照组。

2.3 海马Caspase-3蛋白的表达 见图1，表1。

图1 慢性乙醇中毒模型鼠海马Caspase-3蛋白的表达

表1 3组海马Caspase-3检验结果

3 讨论

长期过量饮酒，常引起脂肪肝、酒精性肝炎及情感及言行反应，表现为恐惧、焦虑不安［8］，少数可出现酒精中毒性精神障碍［9］，临床多见谵妄、幻想及痴呆。神经系统对酒精非常敏感，酒精可引起严重的细胞毒性作用，可导致神经细胞变性坏死、分化延缓、结构破坏，最终致中枢神经系统发育障碍［2，10］。

目前在慢性乙醇中毒模型建立方面，一般采用两种模式即自由饮和灌胃［4-5］。由于考虑到灌胃方式比较接近人们的生活习惯，所以作者以灌胃方式建立慢性乙醇中毒鼠模型。Morris水迷宫实验结果显示模型小鼠均有一定程度的脑功能障碍，小鼠学习记忆功能明显下降。免疫组织化学染色结果表明高、低剂量组小鼠海马区激活型Caspase-3阳性表达率明显高于正常对照组;免疫印迹实验结果显示，该2组Caspase-3总体表达高于正常对照组。Caspase-3激活与高表达是细胞启动凋亡的有效途径，说明慢性乙醇中毒小鼠脑细胞发生了Caspase-3依赖性凋亡。高剂量组小鼠脑功能障碍早于低剂量组，且海马激活型Caspase-3及Caspase-3蛋白总体表达亦高于低剂量组，提示长期过量饮酒会严重损伤饮用者脑细胞。但是，慢性乙醇中毒诱导海马区细胞Caspase-3激活的原因目前不清楚，可能与慢性大量酒精中毒引起海马区细胞变性，释放出超氧化物有关。慢性乙醇中毒引起的记忆力与认知能力下降可能与乙醇诱导脑细胞不同程度的凋亡有关。

［1］Streissguth AP，Landesman-Dwyer S，Martin JC，et al.Teratogenic effects of alcohol in humans and laboratory animals［J］.Science，1980，209(4454):353

［2］Chaudhuri JD.Alcohol and the developing fetus:a review［J］.Med Sci Monit，2000，6(5):1031

［3］Abel EL，Sokol RJ.Incidence of fetal alcohol syndrome and economic impact of FAS-related anomalies［J］.Drug Alcohol Depend，1987，19(1):51

［4］陈旭东，吴伟康，颜建云.白酒灌胃大鼠的氧自由基变化及抗自由基中药的治疗作用［J］.温州医学院学报，2002，32(6):354

［5］Ikonomidou C，Bittigau P，Ishimaru MJ，et al.Ethanolinduced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome［J］.Science，2000，287(5455):1056

［6］Morris R.Development of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat［J］.J Neurosci Methods，1984，11(1):47

［7］毛雪璇，皮荣标.Morris水迷宫实验影响因素的研究进展［J］.中国行为医学科学，2008，17(9):853

［8］Persidsky Y，Ho W，Ramirez SH，et al.HIV-1 infection and alcohol abuse:neurocognitive impairment，mechanisms of neurodegeneration and therapeutic interventions［J］.Brain Behav Immun，2011，25(Supl 1):S61

［9］Cacace S，Plescia F，La Barbera M，et al.Evaluation of chronic alcohol self-administration by a 3-bottle choice paradigm in adult male rats.Effects on behavioural reactivity，spatial learning and reference memory［J］.Behav Brain Res，2011，219(2):213

［10］Sakata-Haga H，Sawada K，Ohta K，et al.Adverse effects of matemal ethanol consumption on development of dorsal hippocampus in rat offspring［J］.Aeta Neuropathol，2003，105(1):30