内皮素受体拮抗剂对肝硬化大鼠转化生长因子β1和Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

陈 汇，许 冰

郑州大学第一附属医院肝胆胰外科郑州450052

内皮素是一种多肽，在体内广泛存在，具有强烈的缩血管作用。已证实［1］内皮素可通过与肝星状细胞(HSCs)表面的内皮素受体结合，在肝硬化门脉高压的发生发展中起重要作用。转化生长因子β1(TGFβ1)是一种重要的致纤维化因子，能促进HSCs向肌成纤维细胞转化，并且分泌大量以Ⅰ型胶原(Col-lagenⅠ)为代表的细胞外基质［2-3］。该研究旨在观察四氯化碳(CCl4)诱导的肝硬化大鼠肝组织TGFβ1和CollagenⅠmRNA表达的变化，以及内皮素受体拮抗剂对其表达的影响，探讨内皮素与TGFβ1在肝硬化门脉高压形成中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 CCl4，分析纯，相对分子质量153.82，北京化工厂生产。药品BQ-123和BQ-788购自Calbiochem公司。RT-PCR相关试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 动物模型制备及实验分组 40只清洁级雄性SD大鼠购自河南省实验动物中心，体质量370～400 g。采用随机数字表法分为正常对照组(NL，n=8)，普通饲养，不做任何处理;其余32只制备肝硬化模型(质量分数50%的CCl4，按3 mL/kg灌胃，6 d 1次，共10次)。模型组32只大鼠进一步分为模型对照组(CCl4，n=8)、内皮素 A 受体拮抗剂组(ETRAa，n=8)、内皮素B受体拮抗剂组(ETRBa，n=8)和联合治疗组(ETRAa+ETRBa，n=8)，后3组内皮素受体拮抗剂处理每天2次(间隔10 h)，分别皮下注射内皮素受体拮抗剂 BQ-123(12.5 μg/kg，10 nmol/min)、BQ-788(15 μg/kg，10 nmol/min)以及 BQ-123+BQ-788(12.5 μg/kg+15 μg/kg，10 nmol/min)。依据前期的试验［4］，上述BQ-123及BQ-788的应用剂量可使血药峰值浓度达到10-7mol/L，此浓度将能够产生最大的阻断作用。

1.3 肝脏组织形态观察 最后一次CCl4灌胃3 d后，禁食12 h，戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉后，打开腹腔，完整切取肝脏。取部分肝组织经体积分数10%甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，5 μm厚切片，HE染色，光镜下观察其病理变化。剩余肝组织置液氮保存，用于提取总RNA。

1.4 肝组织 CollagenⅠ和 TGFβ1 mRNA 测定 采用Trizol试剂提取肝组织总RNA。取肝组织总RNA 4 μg，逆转录合成 cDNA。CollagenⅠ、TGFβ1、GAPDH和β-actin引物序列见表1。取逆转录产物cDNA 1 μL，总体积25 μL，进行PCR扩增。反应条件:94℃预变性2 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，30个循环;72℃后延伸7 min。以Kodak 120凝胶成像系统对DNA扩增带进行图像分析，以CollagenⅠ/GAPDH 和 TGFβ1/β-actin 的比值表示 CollagenⅠ和TGFβ1 mRNA的相对表达量。

表1 CollagenⅠ、TGFβ1、GAPDH 和 β-actin 引物序列

1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0对数据进行分析，采用单因素方差分析比较各组间TGFβ1和CollagenⅠmRNA的表达水平，两两比较采用LSD-t检验，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 肝脏组织形态学观察结果 NL组肝小叶结构正常，肝细胞未见变性及坏死等病变，个别汇管区散在少数淋巴样细胞及单核细胞浸润(图1A)。CCl4组炎症反应最重，肝组织正常小叶结构消失，肝实质被纤维隔包绕，分割成大小不等的假小叶，可见较大范围弥漫的肝损害(图1B)。ETRAa+ETRBa组较CCl4组肝脏炎症反应及纤维化明显减轻，可见散在分布的纤维隔以及汇管区炎性细胞浸润(图1C)。

图1 NL组(A)、CCl4组(B)和ETRAa+ETRBa组(C)大鼠肝脏病理改变(HE，×200)

2.2 各组大鼠肝组织TGFβ1和CollagenⅠmRNA表达的比较 结果见图2、图3和表2。

表2 各组大鼠肝组织TGFβ1和CollagenⅠmRNA的表达

3 讨论

近年研究［5-6］发现HSCs在肝硬化门脉高压的发生发展中具有重要作用。活化的HSCs转化为肌成纤维样细胞，分泌大量以CollagenⅠ为代表的细胞外基质，在肝脏纤维化增殖，尤其是肝小叶内纤维化方面发挥重要作用。TGFβ1可通过多种信号途径活化HSCs，激活 CollagenⅠ启动子，增加 CollagenⅠmRNA 的表达［7］。TGFβ1 的过度表达能增加 CollagenⅠmRNA的表达水平，且TGFβ1与CollagenⅠ蛋白的表达呈正相关［8］。

在该研究中，CCl4组肝组CollagenⅠmRNA表达水平明显升高，炎症反应最重。这可能提示CCl4诱导的肝硬化模型中，多种细胞TGFβ1 mRNA表达水平升高，合成和分泌TGFβ1增加，TGFβ1刺激HSCs分泌细胞外基质，导致细胞外基质在肝脏沉积，产生肝纤维化、肝硬化。

应用内皮素受体拮抗剂后，各治疗组TGFβ1和CollagenⅠmRNA表达水平均低于CCl4组。其中CollagenⅠmRNA显著降低，而TGFβ1 mRNA表达水平降低差异无统计学意义。这可能是由于肝硬化模型中，高表达的TGFβ1 mRNA主要来源于炎性细胞、活化的HSCs以及窦周细胞［8］;应用内皮素受体拮抗剂后，内皮素受体拮抗剂主要阻断了TGFβ1 mRNA的HSCs及窦周细胞来源，而高于NL组的炎性细胞持续存在。因此，TGFβ1 mRNA表达水平较CCl4组虽有所降低，但差异无统计学意义。另一方面，炎性细胞释放细胞因子TGFβ1主要通过活化和分泌已合成的潜在TGFβ1来完成［9］。因此，应用内皮素受体拮抗剂后虽然TGFβ1 mRNA表达水平降低不明显，但内皮素受体拮抗剂仍可能通过阻断TGFβ1的活化和分泌，而抑制CollagenⅠmRNA的表达，显著减轻肝脏纤维化。

综上所述，一方面，内皮素受体拮抗剂可通过内皮素途径抑制HSCs CollagenⅠmRNA的表达，在缓解肝硬化的发生发展、门静脉压力的控制中发挥重要作用;另一方面，内皮素受体拮抗剂可能通过抑制TGFβ1的活化和分泌而增强自身的抗纤维化作用，但其作用机制尚有待进一步研究。

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