对鸡卵黄免疫球蛋白两种提取方法的比较

皮晋魁，张焕容

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

本试验采用水稀释法初提IgY，然后分别用硫酸铵沉淀法和冰乙醇分级沉淀法进一步提取IgY，检测IgY提取量、纯度以及活性效价，为选择较好的鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）提取方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 新鲜鸡蛋 购自成都农业科技职业学院实训中心。

1.1.2 主要设备和试剂 高速冷冻离心机centrifuge 5804、移液器（Eppendorf公司，德国）；电子天平（METTER TOLEDO公司，瑞士）；凝胶成像系统VerSa Doc2000、蛋白电泳仪、核酸蛋白检测仪（Bio-Rad公司，美国）。

0.1mol/L PBS（pH 7.4），0.028mol/L NaCl溶液，95%冰乙醇（-20℃预冷），考马斯亮蓝染液，SDSPAGE脱色液，30%丙烯酰胺，10%SDS，10%过硫酸铵，TEMED；0.1mol/L Tris-HCl（pH 8.8），0.1mol/L Tris-HCl（pH 6.8）；1000μg/mL结晶牛血清白蛋白，禽流感病毒H9亚型和新城疫病毒鸡胚尿囊液。

1.2 提取方法及步骤

1.2.1 卵黄液中水溶性成分（WSF）的分离 新鲜鸡蛋用卵黄分离器去除蛋白，之后将卵黄于滤纸上滚动，吸干，刺破卵黄膜，收集卵黄液。每枚鸡蛋抽取10mL卵黄液，分别置于离心管中，以8倍量去离子水稀释，搅拌10min，使水溶性IgY充分溶出。用0.1mol/L盐酸调节pH值为5.2，4℃静置过夜，然后10000 r/min，4℃离心25min，收集上清液，即得到澄清WSF。

1.2.2 冰乙醇分级沉淀法纯化IgY 取一半制备好的WSF，向其中加入95%冰乙醇，使冰乙醇终浓度达到60%（V/V），离心（10000 r/min，4℃，25min），沉淀用0.028mol/L NaCl溶解，过滤，去除脂蛋白沉淀，滤液再用终浓度为30%的95%冰乙醇沉淀后离心，离心后的沉淀即为IgY，于沉淀中加入10mL 0.1mol/L pH 7.4的 PBS。

1.2.3 硫酸铵沉淀法纯化IgY 取另一半WSF与等体积的0.lmol/L pH 7.4的 PBS混合,搅拌均匀，4℃下逐滴缓慢加入pH 7.0的饱和硫酸铵，至饱和度40%。4℃静置过夜，然后于4℃下11000 r/min离心25min，弃上清，沉淀用与WFS等体积的0.1mol/L pH 7.4的PBS溶解，混合均匀后再逐滴加入饱和硫酸铵至饱和度35%。4℃静置过夜，再11 000 r/min离心25min，弃上清，于沉淀中加入10mL 0.1mol/L pH 7.4的PBS。

1.2.4 SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳） 将冰乙醇法和硫酸铵沉淀法提取的样品各5份和卵黄液样品1份各30μL分别置1.5mL离心管中，加入上样缓冲液30μL，置沸水浴5min，待用。灌制8%分离胶，在分离胶顶部加入水饱和异丁醇，让凝胶聚合半小时。灌制5%浓缩胶，并将梳子插入浓缩胶液体中，让凝胶聚合30min。小心拔出梳子，加入电极缓冲液，在加样孔中依次加入样品以及蛋白质标准品。接通电源，电压90 V下电泳，待蓝色指示剂进入分离胶后改变电压为120 V继续电泳，在蓝色指示剂到达凝胶底部后关闭电源。凝胶冲洗后放入表面皿中，加入考马斯亮蓝染液浸染（覆盖凝胶），置水平摇床上轻微摇动染色1 h。倾去染色液，以脱色液覆盖凝胶，置水平摇床轻微摇动脱色过夜，然后经凝胶成像系统拍照。

1.2.5 IgY血凝抑制效价测定 参照文献检测冰乙醇法、硫酸铵沉淀法所提取的样品和卵黄液样品中的IgY抗新城疫病毒和禽流感病毒H9亚型的血凝抑制效价。

1.2.6 用考马斯亮蓝G250测定IgY蛋白含量 分别取12只试管编号，其中BSA标准品为1～6号，硫酸铵沉淀法提取样品为水1～水3号，冰乙醇法提取样品为醇1～醇3号。按表1要求加入试剂，振荡混匀后于室温下放置5～10min，用核酸蛋白检测仪在595nm处检测样品吸光度值，以不含BSA的吸光度值为空白对照。以标准品吸光度值为纵坐标，相应蛋白含量值为横坐标，绘出标准曲线。根据样品吸光度值在标准曲线上查出对应的蛋白含量，进而计算出样品中的蛋白质含量。

表1 蛋白定量标准品及样品的稀释

2 结果

2.1 SDS-PAGE检测结果 由图1可知，SDS-PAGE凝胶条带显示的提纯蛋白主要集中在60～70KD之间。IgY蛋白重链为67KD，与卵黄总蛋白条带相比，两种方法都有效地纯化出了卵黄抗体IgY，但水稀释-硫酸铵沉淀法提纯的IgY要远多于冰乙醇分级沉淀法的提纯量。

图1 两种方法提取的IgY作SDS-PAGE检测

2.2 IgY血凝抑制效价检测结果 各样品IgY抗新城疫病毒和禽流感病毒H9亚型的血凝抑制效价见表2和表3。水稀释-硫酸铵沉淀法提纯的各IgY样品抗新城疫病毒和禽流感病毒H9亚型的平均血凝抑制效价分别为6.8和9.4，均高于冰乙醇法提取的IgY效价4.4和5.8，而卵黄液抗体抗新城疫病毒和禽流感病毒H9亚型的平均血凝抑制效价分别为7.2和8。

表2 各样品抗新城疫病毒的血凝抑制效价

表3 各样品抗禽流感病毒H9亚型的血凝抑制效价

2.3 IgY蛋白含量检测结果 根据表4中蛋白标准品吸光度值建立图2所示的蛋白定量标准曲线，该标准曲线相关系数R2=0.9717，回归方程为y=0.0012x+0.8769。将两种纯化方法提取的样品吸光度值（OD值）带入回归方程，计算得出各样品的蛋白含量，见表6。两种方法纯化后的卵黄抗体IgY浓度见表7。饱和硫酸铵沉淀法提取IgY的产率为829.67μg/mL，冰乙醇分级沉淀法提取IgY的产率为409.75μg/mL。

表4 蛋白标准品吸光度值

图2 蛋白定量标准曲线

表5 两种纯化方法提取样品的吸光度值

表6 两种纯化方法提取样品的蛋白含量 μg

表7 每1mL卵黄原液纯化后的IgY浓度 μg/mL

3 讨论

用硫酸铵沉淀法提取的IgY含量高于冰乙醇分级沉淀法，这个结果和文献报道的结果一致。SDSPAGE电泳结果显示，各样品最主要的条带基本分布在60～70KD之间，与IgY重链67KD大小相吻合；另外，25～30KD间两种方法均有一条比较淡的条带，属于IgY轻链。由SDS-PAGE电泳结果可以看出，两种方法所提取的IgY纯度均比较高。根据文献，IgY各种提取方法均对其活性有一定影响。本试验中水稀释-硫酸铵沉淀法提取的IgY抗新城疫病毒和禽流感病毒H9亚型的血凝抑制效价与卵黄液血凝抑制效价相当，而水稀释-硫酸铵沉淀法提取的IgY效价高于冰乙醇提取法，与文献中报道的水稀释-硫酸盐提取法对蛋白活性影响较小相吻合。综上，水稀释-硫酸铵沉淀法较冰乙醇法提取的IgY的产率和活性均更高，是相对较好的提取IgY的方法。

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