花椰菜新品种浙801杂交种纯度的SSR鉴定

赵振卿，盛小光，虞慧芳，王建升，张晓辉，顾宏辉

（浙江省农业科学院蔬菜研究所，杭州，310021）

我国是花椰菜生产大国，也是花椰菜种子生产大国，培育、生产的花椰菜种子不仅在国内广泛种植，而且大量出口国外。种子纯度是评价种子质量的关键，也是种子产业的命脉。传统的种子纯度鉴定方法是以播种后植株的田间形态观察为依据，其周期长、工作量大，且易受环境、季节因素影响，导致结果存在偏差。因此，开发快速、准确的种子纯度鉴定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。

SSR标记技术可以通过检测待鉴定样品是否具有某一品种的基因特异片段来辨别其真伪，从而对种子纯度进行检测，具有快速、准确、稳定、安全、不受环境因素影响等优点。目前，SSR标记已被广泛应用于水稻、棉花等作物的杂交种纯度鉴定[1~4]，在甘蓝中也有应用[5，6]，而在花椰菜中尚未见报道。

浙801是浙江省农业科学院蔬菜研究所利用小孢子培养技术选育的中熟花椰菜新品种，通过自交不亲和系繁制的杂交一代商品种。本文通过筛选浙801特异的SSR片段，建立了鉴定浙801杂交种纯度的SSR标记技术体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为花椰菜品种浙801杂交种及其父本和母本，由浙江省农业科学院蔬菜所提供。

SSR引物序列来自于http://www.brassica.info，由Invitrogen公司合成，SSR分析所用到的其他分子生物学试剂均购自北京鼎国生物技术公司。

1.2 试验方法

①播种与取样 浙801杂交种及其父本和母本于2009年夏季播种，每份材料各种植20株，在成熟期经田间形态鉴定后，采集较嫩叶片，于-70℃保存，用于SSR引物的筛选分析；2010年种植制种田生产的待检测的浙801商品种200株，分单株编号，于3~4叶期采集叶片，用于杂种纯度的鉴定试验。

②总DNA的提取 所有材料的DNA均采用CTAB法小量提取，参考Doyle[7]的方法，略加修改。

③SSR分析 SSR的PCR扩增总体积为10 μL，反应体系如下：1×扩增缓冲液，2 mmol/L的 MgCl2，0.2 mmol/L 的 dNTPs，0.5 U Taq酶，2.5 mmol/L 的引物，模板 DNA 50 ng，加 ddH2O 至终体积 10 μL，反应在东胜龙热循环扩增仪上进行。热循环程序为：94℃预变性 2 min，1 个循环；94℃变性 1 min，60℃复性 30 s，72℃延伸45 s，10个循环，循环 1次复性温度降低 0.5℃；94℃变性 1 min，55℃复性 30 s，72℃延伸 45 s，30个循环；4℃保存。

SSR扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，显影采用简易银染法[8]。

2 结果与分析

2.1 浙801杂交种特异带型的筛选

对2009年播种的浙801杂交种及其父本和母本分别于苗期、莲座期、现球期和收获期进行了田间性状的考察，通过株形、叶形、蜡粉、生育期以及花球形态等多方面的综合评价，确定所有供试材料均未出现异型株。

利用SSR引物直接对供试材料进行了筛选，发现引物YP64可以将浙801杂交种与其父母本区分开来（图1）。重复试验表明，此特异片段稳定性和重复性良好。

2.2 浙801杂交种纯度的田间鉴定

对2010年播种的200株浙801商品种以同样方法进行田间鉴定。苗期发现异型株2株，为147号和161号。现球期发现异型株5株，为59号、72号、147号、155号和169号。收获期的调查结果与现球期的一致。最终确定59号、72号、147号、155号和169号为异型株，该批杂交种的纯度为97.5%。

在异型株中，59号、72号、155号和169号表现为母本表型，推测其是由母本自交所产生；147号表现为父本表型，可能是在制种田收获杂种时误收了少量父本。

2.3 浙801杂交种纯度的SSR鉴定

利用SSR引物YP64对200株浙801商品种及其双亲的DNA进行PCR扩增，群体中共有195个单株扩增出杂交种带型（图1），有4株扩增出母本带型（59号、72号、155号和169号），有1株扩增出父本带型（147号），杂种纯度为97.5%，与2.2结果一致。

图1 SSR引物YP64在浙801双亲、杂交种中扩增的电泳检测M：Marker；1：母本；2：浙 801 手工杂交种；3：父本；4～23：141 号～160号浙801商品种，其中10和18分别为异型株147号和155号。

3 小结与讨论

长期以来，育种家们已积累了多种杂种纯度鉴定的方法。如通过调查杂种F1代的育性来判断三系配套生产的杂交种的真伪，但这种方法只能识别出雄性不育系因受温度、光照等因素影响产生微量花粉而自交产生的假杂种，其他来源的假杂种则无法识别。浙801杂交种是通过自交不亲和系繁育的，若要鉴定杂交种的纯度，只能以正常季节种植的F1群体中各单株的外形特征为依据进行判断，因为非正常季节种植的花椰菜外形特征变化很大。此外，外形鉴定法需结合各个时期的性状来综合判断，耗时几个月，而SSR标记来检测杂种纯度则不受播种季节的限制，发芽后采集子叶抽提DNA即可，只需7~10 d就可完成。

本试验筛选出了共显性SSR标记YP64，用于检测浙801商品种的纯度，并与田间性状调查的鉴定结果进行了比较。最终结果表明，SSR标记鉴定的结果与田间鉴定是一致的，而且结果更加客观、可信。本试验中的SSR引物可以明确地检测出母本自交、父本误收因素造成的杂交种混杂，但不能鉴定出由异源花粉污染或机械混杂等造成的异型株。事实上，若采取严格的隔离措施，由后2种因素造成浙801商品种混杂的可能性几乎为零。

下一步研究需要扩大筛选的范围，利用SSR标记构建花椰菜种质资源和育种材料的DNA指纹图谱，从而通过某1对或多对引物的组合区分任意品系或品种。指纹图谱的构建不仅将对杂交种纯度鉴定提供技术支撑，而且在品种权保护等方面具有重要意义。

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