蛞蝓提取物对人肺癌细胞凋亡的影响

曾振东 韦金育 曾翠琼 杨增艳 陈 术

广西民族医药研究院，广西 南宁 530001

蛞蝓治癌来之民间经验，近年有关蛞蝓对肺癌的临床与实验报告表明其对肿瘤的生长确有一定抑制作用，［1－2］但其作用机理还不太清楚。本研究将通过蛞蝓提取物对人肺癌细胞凋亡的体外实验，探讨其抗癌作用机理。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

流式细胞仪为美国Backman coulter Epics XL型;Annexin V－FITC测定试剂盒为美国Backman公司产品。

1.2 蛞蝓提取物

实验用蛞蝓采自南宁市郊区农村，经处理后用乙酸乙酯提取，冰箱保存备用。蛞蝓原动物经广西大学动物科学技术学院专家鉴定为腹足纲蛞蝓科野蛞蝓。

蛞蝓提取物的制备:称取药物49.53g，加入乙酸乙酯150ml，80℃回流1h，抽滤，残渣重复回流一次，合并滤液，减压干燥，浓缩成浸膏样备用。用时1mg先用100uL甲基亚砜 (DMSO)溶解。加入900uL小牛血清培养液，配制成1mg/ml的工作液，即成本实验所用药液。对照组加入10%DMSO培养液。

1.3 细胞株及其培养 人肺癌细胞株A549由广西医科大学实验中心提供。

细胞培养A549细胞培养于含10%小牛血清、100kU/L青霉素和100mg/L链霉素的RPM1－1640培养液中，37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.4 流式细胞光度术检测细胞凋亡

(1)蛞蝓提取物处理的肺癌细胞和空白细胞，胰酶消化，吹打，移至离心管中1000rpm，离心5min。 (2)弃上清，拍打，加PBS 2ml，混匀后再离心1000rpm离心5min弃上清。(3)拍打细胞加Binding Buffer 500μl调整细胞浓度约为5x106cell/ml，置冰盒上。(4)取100μl样本至试管中，加Annexin V－FITC 5μl，PI 2.5μl.反应10min。(5)加450μl Binding Buffer.流式细胞仪检测荧光强度，以分析靶细胞磷脂酰丝氨酸外化率。

2 结果

流式细胞仪检测结合分析表明 (见图1)，肺癌细胞A549与不同浓度药物共同孵育24小时后，靶细胞的磷脂酰丝氨酸 (PS)，由细胞膜内转移到膜外，即出现PS外化。给药组的PS外化率 (即凋亡细胞数)高于空白对照组。不同浓度的药物对细胞的影响各不相同，细胞凋亡率与药物浓度成正相关。见表1。

表1 各实验组细胞不同转归的百分比 (%)

4 讨论

蛞蝓提取物可以抑制人体内外肿瘤的生长，且无明显毒副作用，是近年受人们关注的抗癌动物药。但目前对蛞蝓抗癌的作用机制还不太了解。为了解蛞蝓抗癌机理，我们用蛞蝓提取物对人肺癌细胞凋亡的影响进行了实验研究。我们通过流式细胞术检测表明蛞蝓提取物能诱导A549细胞发生凋亡，其凋亡率达5.3～15.1%，细胞凋亡率与药物浓度成正相关。研究结果提示，蛞蝓提取物对人肺癌细胞A549具有明显的诱导凋亡作用。

细胞凋亡是一个由基因决定的自动结束细胞生命的过程。有专家认为恶性肿瘤是由于细胞增殖和细胞凋亡两种作用相反的生命活动间失去了平衡，表现肿瘤细胞生长优势而形成的，因而细胞凋亡异常是肿瘤形成和发展的一个重要原因。［3～5］通过各种途径和方式诱导、增强肿瘤细胞的凋亡有可能是抑制肿瘤细胞生长的一个重要因素，值得进一步探讨。

［1］郭岳峰，王守章，焦智民等.蛞蝓胶囊治疗晚期非小细胞肺癌32例疗效观察［J］.中医研究，1994，7(3):24.

［2］谢金魁，曹建国.蛞蝓对人肺鳞癌、肺腺癌细胞抑瘤作用初探［J］.肿瘤防治研究，1997，24(6):344.

［3］王申五，武莎莎.凋亡与肿瘤 ［J］.中华肿瘤杂志，1999，21(4):308.

［4］甄永苏.抗肿瘤药物研究与开发 ［M］.北京:化工出版社，2004:101.

［5］柳娜，殷志，庄英识等.蛞蝓糖蛋白提出多糖对肺腺癌作用的实验研究［J］.临床肿瘤学杂志，2008，13(9):779.