KISS-1和MMP-9在51例鼻咽鳞状细胞癌中的表达和临床意义

唐立滨,宋旭东

(1.河北省唐山市人民医院耳鼻咽喉科 063001;2.华北煤炭医学院病理科,河北唐山063000)

运用免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-perosidase,SP)法检测KISS-1和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)在鼻咽癌组织中的表达状况及二者间的相互作用,探讨KISS-1和MMP-9对鼻咽癌生物学行为的影响,揭示鼻咽癌早期转移的形成机制,为临床诊治及预后判断提供理论依据,现将鼻咽癌标本51例及鼻咽慢性炎症组织30例的分析结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选择1999年 1月至 2006年3月在唐山市人民医院初次诊断并手术切除的鼻咽癌石蜡标本51例。所有标本术前均未经任何放疗、化疗和其他抗肿瘤治疗。所有鼻咽癌标本参照1992年福州鼻咽癌TNM分期标准进行分期。其中男38例,女 13例;年龄 23～ 76岁,平均46岁,其中,≤40岁10例,＞40～60岁 26例,＞60岁 15例;病理诊断鼻咽低分化鳞状细胞癌48例,鼻咽高分化鳞状细胞癌3例;颈淋巴结阳性转移组32例,颈淋巴结阴性转移组19例;临床分期中Ⅰ～Ⅱ期12例,Ⅲ～Ⅳ期39例。另外取鼻咽部病理活检证实为鼻咽慢性炎症组织标本30例作对照组。

1.2 试剂及仪器 鼠抗人单克隆KISS-1抗体原液(美国凤凰药业有限公司),鼠抗人单克隆MMP-9抗体(福州迈新生物技术开发公司),CMIAS真彩色医学图像分析系统(北京航空航天大学)。采用即用型SP免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)。

1.3 试验方法 病理置10%中性缓冲甲醛溶液中固定。经标准乙醇梯度脱水,二甲苯透明2次,浸蜡包埋。每个石蜡包埋的病理组织以切片机制备成4μ m厚的切片,连续切片3张,再脱蜡至水。其中1张行HE染色,另外2张分别做KISS-1、MMP-9免疫组织化学染色。

1.4 判定标准 运用双盲法进行交叉阅片并记录。免疫组织化学染色显示KISS-1、MMP-9标志物主要在细胞质内表达,部分在细胞核内表达,呈棕黄色细颗粒。染色结果以着色强度高于背景者判定为阳性。利用CMIAS真彩色医学图像分析系统,为减少人为的影响,以免疫组织化学记分值作为阳性的评判标准。记分值的算式为:H=N×IN代表随机观察的10个高倍镜视野中的平均阳性细胞数,然后按阳性细胞的百分比统计记分。阳性细胞数记分(N):0分:＜10%,1分:≥10%～30%,2分:≥30%～60%,3分:≥60%～75%,4分:≥75%。I代表着色强度记分值。1分:弱(+,淡黄色),2分:中等(++,棕黄色),3分:强(+++,深棕黄色)。显色强度与背景无明显差别者为阴性。若H＞1为阳性,若H≤1则为阴性。0～1分为阴性(-),2～3分为弱阳性(+),4～6分为中等阳性(++),6分以上为强阳性(+++)。

1.5 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件进行数据分析,计量资料以±s表示。组间比较采用χ2检验,P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

KISS-1、MMP-9在鼻咽癌及鼻咽部炎症组织中的表达结果见表1,插Ⅲ图1、2。在各临床病理中的变化见表2。

表1 KISS-1、MMP-9在鼻咽癌及鼻咽部炎症组织中的表达

表2 KISS-1与M MP-9在各临床病理分组间的阳性表达率

3 讨 论

1996年,Lee和Welch[1]运用微细胞介导的染色体转移法(micro cell mediated chromosome transfer,MMCT)发现了KISS-1基因。通过Northern Blot试验证实,在正常的心、脑、肝、肺和骨骼肌组织中可检测到该基因的表达[2],在肾脏和胰腺中微弱表达,而胎盘组织中高表达。Ohtaki等[3]研究发现,KISS-1编码的蛋白质羧基末端(61～121)的54个氨基酸还是人孤儿 G蛋白偶联受体(命名为 hOT7T175、GPR54或AXOR12)的天然配体,而被命名为转移抑素(metastin)。

MMP-9(明胶酶 B)是 MMPs家族中的重要成员,相对分子质量为M r 92×103,它可由结缔组织细胞、巨噬细胞或肿瘤细胞分泌,是降解Ⅳ型胶原最主要的酶,在生理情况下维持细胞外基质、在胚胎发育、组织塑形中起着不可替代的作用[4]。王军等[5]等研究发现,MMP-9在鼻咽癌组织表达率明显高于正常组织。而且,MM P-9在鼻咽癌组织中的高表达与临床病理分期有关,伴淋巴结转移者的阳性表达率与无淋巴结转移者的阳性表达率差异也具有显著性。有研究显示,MMP-9蛋白的表达与临床病理分期和淋巴结转移有关[6-7]。相同的结论在胸部肿瘤、肠道肿瘤及骨肉瘤中得到证实[8-9]。张欣欣等[10]认为鼻咽癌组织中MM P-9蛋白高表达与淋巴结转移有关,可能与鼻咽癌起源于上皮组织,主要经淋巴道转移而非血道转移的机制相吻合。

牛慧彦等[11]研究发现,不同生长时期的异位内膜组织其KISS-1基因和MM P-9基因的表达不同。在异位病灶形成过程中,KISS-1基因的表达受到抑制,使异位内膜具有更强的侵袭能力,更容易种植生长,这与转移性肿瘤中KISS-1基因表达缺失或降低的结果一致[12-13]。同时KISS-1弱表达削弱了对MMP-9基因表达的抑制作用,使MMP-9表达升高,异位内膜组织水解能力增强,异位内膜周围的基底膜被降解,进一步促进异位内膜种植生长,并不断增大。

2001年,Yan等[14]发现,在6个MM P-9 mRNA阳性细胞系中无KISS-1 mRNA表达。有研究发现,与单纯转染空载质粒pcDNA3的对照组相比,转染KISS-1基因的HT1080细胞中MMP-9 mRNA的合成速率明显降低。由佛波酯(PMA)和肿瘤坏死因子α(TNFα)各自激活FRKs基因和 JNFs基因会上调MMP-9表达,而不受 KISS-1影响,说明 KISS-1作用于靶点并非通过蛋白激酶(MAPK)途径。其研究证明,KISS-1并未影响 AP-1、Sp1和 FTs等转录因子与M MP-9启动子结合,而是抑制 NF-κ B与MMP-9启动子结合使后者表达降低。静息状态下 NF-κ B 与抑制蛋白 I κ Bα、Iκ Bβ 结合,以无活性状态存在细胞质内,胞外多种刺激可活化 Iκ B激酶,使 Iκ B磷酸化后降解,NF-κ B随即活化进入核内和相应DNA序列结合,发挥对基因转录、表达控制的作用。KISS-1就是通过使HF1080细胞中 Iκ B含量增加而封锁了 NF-κ B向核内迁移,使 NF-κ B与MMP-9启动子结合减少导致M MPmRNA稳定水平下降,合成速率显著降低。

本研究发现,在鼻咽癌组织中,KISS-1存在表达,且与MMP-9表达状态统计分析二者差异有显著性,成反向表达。这和前人做的相关实验相吻合[11]。因此,同时检测肿瘤组织中KISS-1与 MMP-9的表达,如出现MMP-9呈高表达、KISS-1低表达,提示远处转移的可能性大,建议临床医师尽早做出相应的检查,充分评估患者的临床分期,并制定相应的治疗方案。

总之,通过本实验揭示了KISS-1和M MP-9对鼻咽癌生物活性的影响,进一步证实KISS-1蛋白表达降低、MMP-9表达升高将有助于鼻咽癌的转移和扩散,同时检测二者的表达状况可指导临床及时有效地采取相应的检查和治疗,为评判临床预后提供切实可行的观测指标。

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