超声联合反义c-myc寡核苷酸对移植静脉内膜增生的影响

刘杨东,赵 渝,时 德,彭真年,廖晓刚

(1.重庆医科大学附属第一医院血管外科 400016;2.重庆医科大学病理教研室 400016;3.重庆医科大学电镜教研室 400016)

有研究发现,超声辐照可以诱导平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)的凋亡,抑制SMC的增生,超声辐照还可以促进外源基因在培养的血管细胞内表达。而局部应用人工合成的反义寡核苷酸能有效地抑制移植静脉内膜的增生。现将利用超声辐照联合局部应用反义核苷酸影响移植静脉的研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 动物及分组 新西兰大白兔(重庆医科大学实验动物中心)24只,雌雄不论,体质量3.0～3.5 kg,将其随机分为4组,每组6只。(1)对照组:静脉移植术后仅常规术后处理。(2)超声辐照组:静脉移植术后即日到第7天用超声(0.8 MHz,2.190 W/cm2)辐照2 min,间隔1 min,重复 1次。(3)反义核苷酸组:探头与皮肤间涂超声耦合剂,将溶有吸光值(optical density,OD)为10(约300 μ g)反义c-myc的医用生物蛋白胶均匀涂于移植血管外膜,待蛋白胶充分凝固后,缝合伤口。(4)超声辐照加反义核苷酸组:局部应用c-myc加超声辐照。

1.2 建立模型 颈正中切口,取同侧颈内静脉约2 cm处置入离断的颈总动脉,9-0 prolene缝线间断外翻缝合,术后皮下注射肝素6 250 U。

1.3 仪器 超声辐照仪(重庆医科大学医学超声工程研究所研制,频率为0.8 MHz);声功率(武汉中国声学研究所声功率测定仪,声强强度可调范围为 1.512～3.904 W/cm2)。

1.4 反义C-myc寡核苷酸序列 根据兔c-myc cDNA序列选择相应mRNA翻译起始位点AUG后15和18个碱基设计反义序列(表 1)。5′-GAC GTT GAG GGG CAT-3′由上海生工DNA自动合成仪上合成,经高压液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)纯化、冻干保存,5′和 3′端各3个磷酸二酯键硫代磷酸修饰。PCR引物的设计根据基因库中兔c-myc序列,按PCR引物设计要求,经计算机软件分析设计,同时设计310 bpβ-actin引物作为内对照序列。

表1 PCR扩增引物序列

1.5 影像学检查 术后第2、4周分别对移植侧颈总动脉及移植静脉作彩色多普勒超声(彩超)和数字减影血管造影(digital subtraction angiography,DSA)检查,了解其通畅情况。并于取标本前细心解剖出移植血管近端颈总动脉,插入3F导管,快速推注碘海醇10 mL,行DSA。完毕,导管内注入肝素生理盐水,并保留导管。

1.6 原位灌注固定及标本取材 从造影保留导管注入4%多聚甲醛(含2%戊二醛),待血管内血液冲洗干净后结扎远心端颈总动脉,保持100 cm H2O压力,充分固定 45 min。取下所需血管段,分别固定于4%多聚甲醛和预冷(4℃)的4%戊二醛中,以备光镜和电镜制片。

1.7 移植血管RNA提取 术后第14天,游离出移植的静脉,取含吻合口在内的全部移植血管,每组4条血管,置液氮中保存。组织总RNA的提取按异硫氰酸胍-酶-氯仿一步法进行。

1.8 反转录PCR(reverse transcription,RT-PCR)反应 取1～5μ g RNA模板样品加双蒸水(dd H2O)至11 μ L,按逆转录PCR试剂盒说明书步骤加入反应体系进行PCR扩增,每一反应体系加入c-myc上、下游引物和β-actin内参引物各1 μL(18 μ mcc/L)。PCR仪扩增条件为94℃1 min,60℃1 min,72℃90 s,共计30次循环,最后72℃延伸10 min。

1.9 统计学处理 用SAS 6.12软件系统对数据进行统计分析。计数资料采用χ2检验,计量资料采用 t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

所有实验兔术后均存活,彩超和DSA发现除对照组第4周有1例闭塞外,其余移植血管均通畅。

2.1 组织形态学观察 光镜观察各组移植静脉腔面均有一层内皮细胞覆盖,其下为增生的内膜,主要由大量细胞外基质和SMC组成,第4周较第2周增生明显,且同时段超声辐照组较对照组内膜增生程度轻(插Ⅱ图 1)。电镜下见增生的内膜SMC多呈分泌型,富含粗面内质网、高尔基复合体等,而肌丝成分较少,细胞间质为大量胶原纤维和胶原原纤维,而中膜增厚较内膜轻,其内有较多的成纤维细胞和肌成纤维细胞。对照组SMC合成、分泌较旺盛。而反义核苷酸组及超声辐照加反义核苷酸组可见SMC细胞核固缩、髓样结构,胞质中细胞器含量少等细胞“老化”趋势。

2.2 图像分析结果 超声辐照组、反义核苷酸组、超声辐照加反义核苷酸组与对照组比较,内膜厚度显著降低,分别减少35%、30%和55%(P＜0.01),见表2。

表2 各组内膜、中膜厚度,内/中膜厚度比值(±s,μ m,n=4)

表2 各组内膜、中膜厚度,内/中膜厚度比值(±s,μ m,n=4)

△:P＜0.01,与对照组比较;▲:P＜0.01,与反义核苷酸组比较。

组别 内膜厚度 中膜厚度 内/中膜厚度比值对照组 63±12 75±8 0.84±0.15超声辐照组 41±6△ 64±7 0.64±0.10反义核苷酸组 44±5△ 68±10 0.65±0.05反义核苷酸加超声辐照组 27±7△▲ 60±3 0.45±0.23

2.3 移植静脉(增殖细胞核抗原,proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达 见表3。

2.4 RT-PCR结果(图2) 可见500～600 bp之间和300～400 bp之间分别有一条清晰的条带,符合PCR扩增引物设计的569 bp的 c-myc基因片段和310 bp的β-actin基因片段,3组(对照组、反义核苷酸组、超声辐照加反义核苷酸组)β-actin扩增产物量相似,但反义核苷酸组,超声辐照加反义核苷酸组明显低于对照组,且超声辐照加反义核苷酸组明显低于反义核苷酸组。

2.5 基因表达结果 见表3。术后第 2周,与对照组比较,反义苷酸组基因表达减少了47%(P＜0.05),超声辐照加反义核苷酸组减少74%(P＜0.01)。

图2 RT-PCR扩增产物电泳图

表3 第4周PCNA阳性细胞数比较及免疫组织化学分析(±s,n=4)

表3 第4周PCNA阳性细胞数比较及免疫组织化学分析(±s,n=4)

△:P＜0.05,与对照组比较;▲:P＜0.05,与反义核苷酸组比较。

组别 PCNA阳性细胞数 OD/x对照组 51.2±5.7 1.180±0.073超声辐照组 15.1±2.6△ 0.783±0.156△反义核苷酸组 28.6±1.9△ 0.626±0.144△超声辐照加反义核苷酸组 13.4±0.8△▲ 0.308±0.175△▲

3 讨 论

自体静脉作为移植材料的远期通畅率仍不理想,旁路移植术后失败率约20%～50%[1-2],而冠状动脉搭桥术后10年仅有约60%仍通畅。与人工血管动脉移植后再狭窄的原因相似[3],移植静脉狭窄、闭塞的主要原因仍为内膜增生导致,SMC由中膜向内膜移行并大量增殖,伴有胞外基质的分泌和沉积,是移植静脉内膜增生的核心病理生理机制[4]。近年来采用全身、局部药物治疗、基因治疗、激光照射、血管内放射等治疗方法,但效果均不理想。张俊霞等[5]研究发现,超声辐照在无明显杀伤细胞的情况下可以诱导SMC凋亡,阻止SMC S期DNA复制。本研究前期发现,超声辐照可以降低移植静脉SMC的增殖,减轻内膜的增生[6]。

血管SMC受到外界因素刺激后,细胞内通过一系列信号转导作用,启动细胞的内调节增殖的基因表达,其中原癌基因在启动细胞增殖过程中起着重要作用。C-myc原癌基因编码一种短暂的,与核磷蛋白结合的特异DNA序列来调节DNA转录。起着启动和维持细胞增殖的双重作用。转染反义cmyc寡核苷酸进入细胞,通过碱基互补的原则与靶RNA结合,形成DNA∶RNA杂交体,从而启动细胞内RNA酶,迅速将mRNA降解,使mRNA的翻译功能减弱或消失,不能产生有效的作用蛋白,由此来抑制靶基因的表达,进而抑制细胞增殖。有研究发现,局部应用生物蛋白胶和多聚凝胶携载反义cmyc ODN,可以显著抑制移植静脉内膜的增生。本研究中发现,术后第4周反义c-myc组内膜厚度较对照组降低了30%(P＜0.05)。

基因表达是由DNA转录产生mRNA,再经修饰形成成熟的mRNA。成熟的mRNA经翻译表达相应蛋白质和多肽而发挥作用。因此,对细胞内相关mRNA表达水平的检测,能了解该基因在细胞活动中的作用是否活跃。RT-PCR是对细胞内某一特定基因序列进行大量扩增后,检测该基因mRNA在细胞中的表达水平,在实验条件控制一致时,可半定量对比细胞mRNA含量的多寡,从而判断细胞基因的表达水平。本实验结果表明,术后第2周,反义核苷酸组和反义核苷酸加超声辐照c-myc基因表达与对照组比较,减少了47%和74%(P＜0.01),说明反义c-myc寡核苷酸能有效抑制c-myc靶基因的表达,进而抑制细胞的增殖和内膜增厚。局部超声辐照能促进反义c-myc向细胞内转化,进一步加强对c-myc基因表达的抑制作用,加之超声本身对内膜增生的抑制作用使内膜增厚进一步减轻。本研究中观察到内膜厚度减轻了55%(P＜0.01),说明局部应用反义c-myc与超声辐照的协同作用。

超声辐照促进外源基因转化的机制尚不清楚,可能与细胞膜的通透性改变有关。在合理控制超声辐照条件下,超声既能使膜通透性增加,又不致使细胞明显受损,而细胞膜通透性改变是基因转化的前提。Wybex等[7]报道,20 kHz,20 w/cm2的超声辐照30 s使质粒转入酵母为对照的20倍。Miller等[8]应用超声1 M Hz,0.4 w/cm2辐照 60 s或 30 min,48 h后显示,血管平滑肌细胞荧光素酶活力分别增加7.5倍和2.4倍。超声通过机械作用和空化效应声也可影响细胞膜通透性。但主要源于空化效应,压力波作用于细胞,仍是通过引起贯性空化(inertial caritation)而致细胞结构和(或)功能变化。kim等[9]和Bao等[10]证实,空化效应是影响细胞膜通透性的主要因素。用超声行基因转化和表达,学者们的报道结果不尽相同。如连续波和非连续波的转化率在不同报道中差异甚大。造成差异的原因除目的基因和受体细胞外,超声系统及辐照条件也是重要影响因素。由于声强表示方法和辐照剂量计量方法的多样性,以及辐照过程中采用的透声介质、溶液组成、有无增强空化的因素存在等,给检测结果比较带来困难。Bao等[10]报道,辐照过程中旋转试管与否转化结果差异大,认为旋转有利于产生空化。既使细胞膜的通透性增加以利基因导入,又不致因超声辐照而使细胞发生不可逆的损伤是达到满意转化率和表达率的前提。

本研究选择的超声参数源于细胞实验时探索的理想参数,与Lawrie[11]等和Fitzgerald等[12]研究接近。但与Arakawa等[13]相差较大。由于体内实验存在组织对超声能量的吸收,采用更高声强、其他频率和作用时间的超声是否对内膜增生抑制和基因转化更有利还不清楚,有待进一步探明。

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