桂西地区壮族人群肾素—血管紧张素系统基因多态性分析

尤燕舞，黄海玲，林 栩

(1右江民族医学院附属医院，广西百色533000;2右江民族医学院组胚教研室)

肾素—血管紧张素(RAS)系统对水、电解质平衡及血压调节起重要作用，不同个体RAS的活性不同，也同时受系统组成成分的表达以及活性的影响。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)具有直接的缩血管作用，是RAS中最重要的活性介质之一。研究证实，AngⅡ在人体中主要通过血管紧张Ⅱ1型受体(AT1R)发挥作用，决定AT1R蛋白表达的基因是否存在某种或某些变异，影响着AT1R的结构及功能，从而影响RAS的活性效应。血管紧张素Ⅰ转化酶(ACE)催化AngⅠ转化为AngⅡ，是RAS系统中的关键酶，可同时灭活有舒血管作用的缓激肽，与血管内皮增生及多种细胞因子的作用密切相关。RAS中另一候选基因为血管紧张素原(AGT)基因，其第2外显子704 T/C变异导致编码产物第235号甲硫氨酸变为苏氨酸(M235T)，AGT M235T多态与血浆AGT水平有关。2011年4～6月，本文对 AT1R基因A1166C、ACE基因I/D和AGT基因M235T多态性进行了研究，以确定其在桂西地区正常壮族人群中的分布。

1 资料与方法

1.1 临床资料 桂西地区壮族人150例，男78例、女72 例，年龄(42.6 ±11.2)岁，血常规、血脂及其他生化指标均在参考范围内，心电图检查正常，排除肝脏、肾脏、内分泌和心脑血管疾病。研究对象均来自右江民族医学院附属医院，为正常健康体检者，且相互间无血缘关系。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 采集体检健康者静脉血3 ml，用 EDTA－K2抗凝，采用改良碘化钠法提取白细胞基因组DNA，－86℃保存备用。

1.2.2 AT1R基因 A1166C多态性检测 采用PCR－RFLP 法。正引物为:5'－CACCATGTTTTGAGGTT－3'，负引物为:5'－CGAGTTTCTGACATTGTTC－3'。建立50 μl的反应体系后，放入PCR扩增仪:变性94℃ 300 s，退火50℃ 120 s，延伸72℃ 120 s，30个循环后，在72℃充分延伸10min，PCR产物在37℃用DdeⅠ水解过夜。电泳可见277 bp的等位基因11662A片段(切点消失)，等位基因11662C(切点存在)呈167 bp及110 bp两个片段。

1.2.3 ACE基因I/D多态性检测 采用直接PCR法。正引物为 5'－CTGGAGACCACTCCCATCCTTTC－3'，负 引 物 为 5'－GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT－3'。PCR 体系为50 μl。变性、退火和延伸条件分别为94℃ 1min，58℃ 2min，72℃ 2min，共30个循环。电泳可见D等位基因PCR扩增产物为190 bp，I等位基因PCR扩增产物为490 bp。

1.2.4 AGT基因 M235T多态性检测 采用 PCR－RFLP 法。 正 引 物 5'－CCGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT－3';负引物 5'－CAGGGTGCTGTCCACACTGGACCCC－3'。PCR 体系为 50 μl。在 94 ℃ 变性 3min。冰浴后加入Taq酶2 U混匀，再加石蜡油30 μl，进行94℃ 15 s变性，65℃ 50 s退火，72℃ 45 s延伸，循环35次。Takara内切酶TthⅢ 1酶切，65℃水浴3 h。电泳可见基因型有3种:纯合子MM只见1条163 bp电泳带，纯合子TT可见140 bp电泳带，杂合子TM可见163 bp、140 bp两条电泳带。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件，计数资料以率表示，比较采用χ2检验和方差分析，用Hardy－Weinbery遗传平衡定律确认各基因频率是否达到遗传平衡。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 AT1R基因A1166C多态性在不同种族人群间的比较 见表1。

2.2 ACE基因I/D多态性在不同种族人群间的比较 见表2。

2.3 AGT基因M235T多态性在不同种族人群间的比较 见表3。

表1 不同种族AT1R基因A1166C多态性分布频率的比较［例(%)］

表2 不同种族ACE基因I/D多态性分布频率的比较［例(%)］

表3 不同种族AGT基因M235T多态性分布频率的比较［例(%)］

3 讨论

肾素是一种酸性蛋白质，由肾脏近球细胞合成和分泌后，经肾静脉进入血循环。血浆中的AGT为肾素底物，在肾素的作用下水解，产生一个十肽即血管紧张素Ⅰ。血管紧张素Ⅰ的血管活性非常低，但在经过肺循环时，可在肺血管内皮表面的ACE作用下水解，产生一个八肽即血管紧张素Ⅱ。血管紧张素Ⅱ在血浆、组织中的血管紧张素A作用下，失去一个氨基酸，成为七肽的血管紧张素Ⅲ。血管紧张素Ⅱ和血管紧张素Ⅲ与血管平滑肌、肾上腺皮质等组织细胞的血管紧张素受体结合，引起相应的生理效应。血管紧张素Ⅱ与其受体结合后，可作用于全身多个系统，对心肌肥厚、心力衰竭、高血压、血管疾病、糖尿病、肾脏疾病等的发生、发展均有重要作用。RAS系统相关基因的多态性近年来成为研究热点，研究较多的是AT1R基因A1166C、ACE基因I/D和AGT基因M235T多态性。桂西地区作为少数民族聚居地，以壮族人群居多，本文研究桂西地区壮族人群RAS系统AT1R基因A1166C、ACE基因I/D和AGT基因M235T多态性的分布频率，并与不同种族人群进行比较。

本文采用PCR－RFLP技术及 DNA测序法首次获得了桂西地区壮族人群RAS系统AT1R基因A1166C、ACE基因I/D和AGT基因M235T多态性的分布情况。结果显示，三者等位基因频率在桂西地区壮族人群中分别为 92.0%、8.0%，53.3%、46.7%，13.3%、86.7%。与国外同类研究结果比较，桂西地区壮族人群AT1R基因A1166C基因型和等位基因频率与土耳其人［1］比较有统计学差异，而与日本人［2］、中国其他地区人群［3，4］比较无统计学差异;桂西地区壮族人群ACE基因I/D基因型频率与法国人［5］、土耳其人［1］比较有统计学差异，而等位基因频率无统计学差异，基因型和等位基因频率与黎巴嫩人［6］、巴林人［7］比较差异有统计学意义，而与蒙古族人［8］、日本人［2］比较差异均无统计学意义;桂西地区壮族人群AGT基因M235T基因型和等位基因频率与法国人［5］、蒙古族人［8］、土耳其人［1］、波兰人［9］比较差异有统计学意义，而与日本人［2］比较差异均无统计学意义。这些结果提示RAS系统基因多态性在不同种族间分布频率存在差异，这种差异势必会对RAS系统基因在一些疾病特别是地方高发性疾病发生、发展中的作用造成一定的影响。

［1］Özkaya O，Söylemezoĝlu O，Gönen S，et al.Renin－angiotensin system gene polymorphisms:association with susceptibility to Henoch－Schonlein purpura and renal involvement［J］.Clin Rheumatol，2006，25(6):861－865.

［2］Hishimoto A，Shirakawa O，Nishiguchi N，et al.Association between a functional polymorphism in the renin－angiotensin system and completed suicide［J］.J Neural Transm，2006，113(12):1915－1920.

［3］郭明秋，李莉，苗翠，等.ACE基因和AT1R基因多态性与糖尿病相关性的研究［J］.华中医学杂志，2007，31(1):25－27.

［4］李荣，张宁，康莉，等.肾素—血管紧张素系统基因多肽性与IgA肾病的关系［J］.临床荟萃，2007，22(10):685－688.

［5］Mondry A，Loh M，Liu P，et al.Polymorphisms of the insertion/deletion ACE and M235T AGT genes and hypertension:surprising new findings and meta－analysis of data［J］.BMC Nephrol，2005，6(1):1－11.

［6］Sabbagh AS，Otrock ZK，Mahfoud ZR，et al.Angiotensin－converting enzyme gene polymorphism and allele frequencies in the lebanese population:prevalence and review of the literature［J］.Mol Biol Rep，2007，34(1):47－52.

［7］Al－Harbi EM，Farid EM，Gumaa KA，et al.Angiotensin－converting enzyme gene polymorphisms and T2DM in a case－control association study of the Bahraini population［J］.Mol Cell Biochem，2011，350(1－2):119－125.

［8］Wang GY，Wang YH，Xu Q，et al.Associations between RAS gene polymorphisms，environmental factors and hypertension in Mongolian people［J］.Eur J Epidemiol，2006，21(4):287－292.

［9］Niemiec P，Zak I，Wita K.The M235T polymorphism of the AGT gene modifies the risk of coronary artery disease associated with the presence of hypercholesterolemia［J］.Eur J Epidemiol，2008，23(5):256－262.