腺病毒介导的鸟氨酸脱羧酶反义RNA对乳腺癌细胞生长侵袭的抑制作用

邓文胜，万小卫，卢 军，孙金娥，马 榕，刘贤锡，孙学英

(1山东省警官总医院，济南250002;2山东大学齐鲁医院;3山东大学医学院分子生物学实验中心;4新西兰奥克兰大学医学院分子医学系)

鸟氨酸脱羧酶(0DC)是多胺生物合成途径中的关键酶和限速酶。据报道，ODC在多种肿瘤细胞中表达增高，与肿瘤转移、复发有一定关系。2007年1月～2008年4月。我们检测了ODC基因在乳腺癌MDA－MB－231细胞中的表达并观察了腺病毒介导的ODC反义RNA(rAd－ODC/Ex3as)对乳腺癌细胞体外增殖的抑制作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 乳腺癌 MDA－MB－231细胞(以下简称乳腺癌细胞)和正常乳腺上皮MCF－10A细胞(以下简称正常乳腺细胞)由澳大利亚Monash大学分子生物学实验室提供;羊抗人ODC多克隆抗体、鼠抗人Pan－actin单克隆抗体购于 Sant Cruz Biotechnology;BCA试剂盒购自碧云天公司;相关试剂分别购自Pierce公司、BD公司。rAd－ODC/Ex3as(以下简称反义RNA)和rAd－绿色荧光蛋白(GFP)由山东大学医学院分子生物学实验中心包装完成。

1.2 乳腺癌细胞与正常细胞ODC蛋白表达检测将两种细胞株用0.15%的胰酶消化成单个细胞，2 700 r/min离心3min，去上清，加适量 DME/10%FBS重悬，配成5×105个/ml细胞悬液，接种细胞时根据不同细胞系生长速度的不同，分别接种不同的细胞数于直径10cm的培养皿中。培养48 h后，观察细胞达到对数生长期，开始收获细胞，采用Western Blot法检测。

1.2 细胞干预及相关指标测定 将乳腺癌细胞及正常乳腺细胞分别用0.15%的胰酶消化成单个细胞，2 700 r/min×3min离心，去上清，加适量DME/10%FBS重悬，配成5×105个/ml细胞悬液，接种于直径10cm的培养皿中培养48 h。取对数生长期细胞按5×103个/孔接种于96孔培养板，于37℃、5%CO2培养箱中培养并24 h并分为三组，每组6个复孔。反义RNA组以50 MOI(=空斑形成单位/细胞数)反义RNA转染细胞;空载体组以50 MOI的Ad－GFP感染细胞;对照组不干预。处理后24、48、72、96 h 加入 0.5%MTT(5 mg/ml)，每孔 20 μl，孵育4 h再加入二甲基亚砜150 μl溶解紫蓝色沉淀，观察以下项目:①细胞增殖抑制率:酶标仪测定各组570 nm波长值，绘制细胞生长曲线。抑制率=(1－实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。②ODC蛋白表达:干预后各组细胞均于DME/10%FBS的培养基中继续培养，48 h后裂解细胞。采用Western Blot法测定ODC蛋白表达。③细胞周期:细胞干预48 h后胰酶消化，PBS洗涤，加入预冷70%乙醇1 ml，4℃固定12 h;PBS洗涤，加入4 ug RNA酶，室温保湿30min;加入终浓度为20 μl/ml的碘化丙啶(PI)孵育30min。流式细胞仪检测细胞周期，计算G0－G1期细胞百分率。④细胞增殖、侵袭能力:各组均行基底膜侵袭试验，Transwell小室(孔径8 μm)表面覆盖终浓度为0.7 mg/ml的基质胶，放入 6孔板中，下层加入 2.6 ml DME/10%FBS。细胞干预24 h后胰酶消化收集细胞，小室上层加入1.5 ml细胞悬液(浓度为5×105个/ml)。Transwell小室于37℃、5%CO2下孵育4 h，用棉签抹去未穿过的细胞，固定小室底部的细胞并行HE染色。每孔选取5个不同的区域，于200×显微镜下计数穿过的细胞数。

1.4 统计学方法 采用SPSS10.0软件行统计学处理，t检验;P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞生长抑制率 空载体组细胞生长迅速，反义RNA组细胞生长明显减慢，细胞生长曲线更趋低平(图2)，细胞增殖最大抑制率为60%。

2.2 ODC蛋白表达 见图1。

图1 各组ODC蛋白表达

2.3 细胞周期 干预后48 h反义RNA组细胞周期停止于G1期，G1期细胞比例明显高于对照组(表1)，空载体组与对照组比较差异无统计学意义。

表1 各组细胞周期及穿膜细胞数(n=6，±s)

表1 各组细胞周期及穿膜细胞数(n=6，±s)

注:与对照组比较，*P＜0.01;与空载体组及对照组比较，△P＜0.01

组别 G0～G1细胞(%) 穿膜细胞(个)空载体组 31.94 ±5.81* 40.20 ±5.86*28.56 ±3.63 45.00 ±3.45反义 RNA组 76.15±5.13＊△ 20.97±5.30＊△对照组

3 讨论

多胺是一类脂质阳离子，包括腐胺、精咪和精胺，鉴于其代谢、摄取和功能可作为肿瘤预防和治疗的靶位［1，2］，多胺生物合成抑制剂或多胺类似物理论上可阻断肿瘤细胞生长与转移 。ODC是多胺合成的关键酶，可催化鸟氨酸转变为腐胺［3］，众多研究表明，多胺/ODC途径与乳腺癌有密切关系。Mimori等［4］报道，ODC过表达与较年轻女性、肿瘤体积较大及预后较差者有显著相关性。Glikman等［5］报道，正常乳腺组织和良性乳腺疾病组织中均检测不到ODC表达，而表达较高水平ODC的恶性乳腺肿瘤细胞则具有较高的细胞质构成、核间变以及较低的组织分化。Kubotas等［6］则认为，ODC过表达不仅与乳腺癌细胞的转化，而且与其侵袭性有关。本研究结果显示，乳腺癌细胞ODC基因表达明显高于正常乳腺细胞，与上述研究结果相符。

反义RNA技术是一种从核酸复制、转录和翻译水平上高度特异性抑制靶基因表达的方法，可选择性、序列特异性抑制基因表达。其主要包括反义RNA技术和反义寡核苷酸技术，是目前最常用的体细胞基因治疗方法之一。腺病毒载体具有体内基因转移能力，可有效感染非分裂期细胞，并携带大量的基因片段;重要的是其携带的基因不整合到宿主细胞染色体上，可大大降低由整合而带来的危险性。腺病毒载体可有效转染静息期细胞，因此可将携带外源基因的重组腺病毒载体直接注入组织中，原位感染组织细胞;其表达时间较长，通过选择病毒的分布方式，也可将基因转移局限在某一靶器官中。

反义RNA是一种能表达ODC第三外显子反义RNA的重组腺病毒，本研究结果显示，乳腺癌细胞转染反义RNA后ODC蛋白表达受抑，生长明显减慢，提示抑制ODC表达可抑制乳腺癌细胞生长;反义RNA作用后停留于G1期的细胞增多，表明其可使乳腺癌细胞周期阻滞于G1期。其机制可能为反义RNA通过p53非依赖途径诱导p21过表达，从而抑制 CDK 活性，致使细胞周期阻滞［7～9］。

侵袭和转移是恶性肿瘤最显著的特征，是一个多步骤的过程［10］，研究证实，ODC活性与间质金属蛋白酶2、丝裂原活化蛋白激酶活性(Erk磷酸化)有密切关系;抑制 ODC活性可能抑制 MMP－2及MAPK活性从而减慢对IV型胶原的降解，导致细胞侵袭能力降低［11］。本研究反义RNA组穿膜细胞数远低于对照组，提示下调ODC活性有可能降低癌细胞的侵袭性。

总之，ODC活性升高与乳腺癌发生及侵袭有一定关系，ODC有可能作为一个乳腺癌的独立预后指标;rAd－ODC能降低ODC蛋白表达从而抑制其活性，使细胞增殖停滞于G1期，并抑制乳腺癌细胞生长和侵袭。本研究为乳腺癌的基因治疗研究提供了理论依据。

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