心房钠尿肽对力竭小鼠肾脏的抗氧化作用及其机制探讨

孙继新，洪 兰，于 丽，李海雁，刘丽萍*

(1延边大学体育学院体育教育系，吉林延吉133002;2延边大学医学部)

心房钠尿肽(ANP)于1981年由 De等［1］在心房提取物中被发现，目前其作为一种快速反应型激素的抗氧化作用引起临床的广泛关注。研究发现，ANP参与了心力衰竭时的抗氧化过程，具有减轻心力衰竭氧化损伤的作用［2］;对乳鼠心肌细胞具有保护作用［3］。我们前期研究发现，ANP对力竭小鼠骨骼肌具有抗氧化作用。2010年10月～2011年5月，我们观察了ANP对力竭小鼠肾脏的抗氧化作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 ANP(北京北方生物技术研究所);KT5823(环—磷酸鸟苷依赖性的蛋白激酶阻断剂;购自美国Sigma公司);丙二醛(MDA)及组织蛋白测试盒(南京建成生物工程研究所);其他试剂均为国产分析纯。实验动物为昆明种小鼠(雄性，体质量18～22 g，由延边大学医学部提供，饲养环境温度为25℃，湿度为70%)。721分光光度计(上海第三仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 力竭小鼠肾组织乳酸(LD)含量测定 将基础游泳时间的标准差＜10min的18只小鼠随机分为对照组、应激组和游泳力竭组。对照组直接脱颈处死取肾脏;应激组于(30±2)℃的水中自由活动(20±2)s后取肾脏;力竭组尾部负重(体质量的10%)游泳(水深20cm，水温等同应激组)，至力竭(在水下10 s仍不能浮出水面)后立即处死肾脏。肾脏取出后用冰冷的生理盐水冲洗，滤纸吸干称重，冰浴下制备成5%的匀浆液。采用化学比色法测定各组肾组织匀浆液LD含量，严格按照测试盒说明书操作。

1.2.2 血浆ANP水平测定 各组均于取肾脏同时断头取血，EDTA抗凝，1 500 r/min离心10min取血浆;放射免疫法［4］测定ANP水平。

1.2.3 ANP对H2O2诱导后肾组织MDA含量的影响 另取24只小鼠脱颈处死，立即取出肾脏，制备成30%的肾脏组织匀浆液分装，分为对照组、H2O2组、ANP 组、KT5823 组，每管 200 μl;所有试管均置于37℃恒温水浴中，H2O2反应浓度为0.5 mol/L;ANP最终反应浓度为1.31 ng/ml;KT5823反应浓度为10－5mol/L。按以下步骤操作:①KT5823组加入20 μl的KT5823;其它试管均加等量生理盐水，震荡恒温水浴中孵育15min;②ANP组和KT5823组分别加入ANP 20 μl，其它试管均加等量生理盐水，孵育15min;③H2O2组、ANP组、KT5823组分别加入20 μl的 H2O2，对照组给等量生理盐水，孵育15min。采用比色法测定各组MDA含量，严格按测试盒说明书操作。

1.3 统计学方法 采用Prism(3.0版)软件行统计学处理。计量结果用±s表示，显著性差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾组织乳酸含量及血浆ANP水平 见表1。

表1 各组肾脏组织中LD含量和血浆ANP含量(±s)

表1 各组肾脏组织中LD含量和血浆ANP含量(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与应激组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

组别 n LD(mmol/g prot) ANP(ng/μl)6 0.39 ±0.01 9.49 ±0.70 6 0.43 ±0.02 9.89 ±1.09力竭组 6 0.56 ±0.04＊＊# 13.15 ±1.65*##对照组应激组

2.2 ANP对H2O2作用后肾组织MDA含量的影响 见表2。由表2可见，H2O2组MDA含量明显高于对照组，说明H2O2已导致肾脏组织损伤;ANP组MDA含量明显低于对照组，ANP有明显的抗氧化作用;KT5823组MDA含量明显升高证实KT5823阻断了ANP的抗氧化作用。

表2 ANP对H2O2作用后肾脏MDA含量的影响(±s)

表2 ANP对H2O2作用后肾脏MDA含量的影响(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.01;与 H2O2组比较，#P ＜0.001;与ANP组比较，△P＜0.001

组别 MDA含量(nmol/mg prot)H2O2组 11.20 ±0.71*6.67 ±0.17 ANP 组 4.15 ±0.21#KT5823 组 9.28 ±1.35△对照组

3 讨论

近年来，ANP的抗氧化作用逐渐成为研究热点。Fürst等［5］研究结果表明，ANP 通过激活 Rho GTP酶家族成员(Rac1)、NADPH氧化酶(Nox)及其类似物Nox2来诱导人内皮细胞的蛋白激酶磷酸化，认为ANP参与了氧化应激过程。我们的前期研究表明，外源性ANP对大鼠肾缺血—再灌注损伤具有一定的抗氧化保护作用［6］;以上均是在病理或正常情况下对ANP抗氧化现象进行的初步观察。另有很多学者观察到最大负荷强度和力竭运动后正常人和耐力运动员ANP水平均显著提高;表明心脏内分泌功能对运动训练具有一定的适应性，但这种代偿反应所起的作用及其作用机制的研究鲜有报道。

本研究表明，力竭运动小鼠血浆ANP水平明显增加，此与其他学者的研究结果吻合［7，8］。为证明其生成的ANP是否具有抗氧化作用，本研究做了H2O2氧化损伤肾脏的离体实验，结果表明ANP组MDA含量明显低于对照组，表明ANP对H2O2损伤肾脏具有明显的保护作用;运动时ANP升高的是一种代偿作用，有助于改善和保护力竭运动时肾脏组织的氧化损伤状况;ANP的这种抗氧化作用也为治疗缺血再灌注导致的肾脏组织氧化损伤提供了依据。

以往的研究表明ANP在体内发挥生物学作用时与心脏、血管、中枢神经系统、淋巴组织、生殖器官及肾脏组织等以结合形式存在的A型钠尿肽受体(NPR-A)结合，在鸟苷酸环化酶的催化下，催化底物GTP生成环一磷酸鸟苷(cGMP)而发挥其舒张血管、降低血压、利钠利尿、抑制细胞增殖以及参与脂质代谢等作用［9，10］。因cGMP的下游信号转导物质是PKG，为了探讨运动状态下ANP生成增多或增加外源性的ANP其抗氧化作用是否亦通过这条信号转导途径实现，本研究用PKG阻断剂KT5823做了预处理，结果发现，KT5823能够阻断ANP对氧化损伤肾脏组织的保护作用，说明ANP抗氧化作用是通过增加cGMP依赖性的蛋白激酶途径实现的。

综上所述，力竭运动时血浆ANP明显增加;这种代偿反应参与了肾脏组织的氧化保护作用，其作用机制可能是涌过ANP增加使GTP生成cGMP，从而激活PKG信号转导通路实现的。

［1］de Bold AJ，Borenstein HB，Veress AT，et al.A rapid and potent natriuretic response to intravenous injection of atrial myocardial extracts in rats［J］.Life Sci，1981，28(1):89-94.

［2］Shono M，Yoshimura M，Nakayama M，et al.Predominant Effect of A-Type Natriuretic Peptide on Reduction of Oxidative Stress During the Treatment of Patients With Heart Failure［J］.Circ J，2007，71(7):1040-1046.

［3］Laskowski A，Woodman OL，Cao AH，et al.Antioxidant actions contribute to the antihypertrophic effects of atrial natriuretic peptide in neonatal rat cardiomyocytes［J］.Cardiovasc Res，2006，72(1):112-123.

［4］Cho KW，Kim SH，Kim CH，et al.Mechanism basis of atrial natriuretic peptide secretion in beating atria:atrial stroke volume and ECF translocation［J］.Am J Physiol，1995，268(5 pt 2):1129-1136.

［5］Fürst R，Brueckl C，Kuebler WM，et al.Atrial Natriuretic Peptide Induces Mitogen-Activated Protein Kinase Phosphatase-1 in Human Endothelial Cells via Rac1 and NAD(P)H Oxidase/Nox2-Activation［J］.Circ Res，2005，96(1):43-53.

［6］李英顺，申东洙.心房钠尿肽在大鼠肾缺血再灌注损伤中的体外抗氧化作用研究［J］.中国西部科技，2009，11(8):31-32.

［7］Edwards JG.Swim training increases ventricular atrial natriuretic factor(ANF)gene expression as an early adaptation to chronic exercise［J］.Life Sci，2002，70(23):2753-2768.

［8］Gutkowska J，Paquette A，Wang D，et al.Effect of exercise training on cardiac oxytocin and natriuretic peptide systems in ovariectomized rats［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2007，293(1):R267-R275.

［9］Calderone A，Thaikcm，Takahashi N，et al.Nitric oxide，atrial natriuretic peptide，and cyclic GMP inhibit the growth-promoting effects of norepinephrine in cardiac myocytes and fibroblasts［J］.J Clin Invest，1998，101(4):812-818.

［10］Lafontan M，Berlan M，Stich V，et al.Recent data on the regulation of lipolysis by catecholamines and natriuretic peptides［J］.Ann Endocrinol，2002，63(2 Pt 1):86-90.