基于ITS2条形码的中药材威灵仙与其易混伪品的鉴定

曾旭 李莉 业宁 姚辉 刘志华 秦民坚

2010版《中国药典》规定威灵仙为毛茛科植物威灵仙ClematischinensisOsbeck，棉团铁线莲ClematishexapetalaPall.或东北铁线莲ClematismanshuricaRupr.的干燥根及根茎[1]。威灵仙具有祛风湿，通经止痹痛等功效，凡风湿痹痛，麻木不仁，无论上下，皆可应用，是治疗风湿痹痛的要药。作为中国常用中药由于用药历史悠久，分布范围广泛，地区用药习惯差异较大，威灵仙药材使用混乱现象十分严重。北方常见百合科菝葜属Smilax植物作威灵仙入药，而南方常见以毛茛科铁线莲属Clematis植物作威灵仙入药[2,3]。云南部分地区菊科植物显脉旋复花InulaneruosaWall.的根茎及根作威灵仙入药。四川地区，金粟兰科植物草珊瑚Sarandraglabra(Thunb.)NaRai的干燥根茎及全草作铜脚威灵仙入药[4]。由于缺乏专业的鉴定人员加之市场需求量大致使威灵仙药材常借不应求，广东地区曾发生过威灵仙与桃耳七混用的情况，造成数十人中毒的严重后果[5]。也曾出现过将毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥须根加工染色来冒充威灵仙使用[6]。由此我们急需一种迅速、简便有效的方法来鉴别威灵仙药材与其混伪品，为保证药材的真实性和指导临床用药安全提供科学依据，有必要对威灵仙正品来源与其各地混用品种进行鉴别研究。

DNA条形码(DNA barcoding)是近年来生物分类和鉴定的研究热点和方向，该技术是利用基因组中一段公认的标准的、相对较短的DNA片段来对物种进行准确鉴定。通过种间具有足够的变异、种内特异性而创建的一种新的生物身份识别系统，从而实现对物种的快速自动鉴定[7,8]。自2003年由加拿大分类学家PaulHebert首次选取以线粒体细肥色素C氧化酶亚基(COI)对动物物种进行分析，发现无论在哪个分类水平上该基因都具有良好的识别能力，该技术得到了各国专家的广泛关注[9,10]。对于植物来说，通用的DNA条形码序列仍未最终确定世界各地者都称极投入到植物通用条形码的研究当中，得到了初敊的可喜成果。陈士林课题组选取真核生物rDNA位于5.8S和26S rRNA之间的一段顺反子ITS2序列进行研究，发现ITS2序列不仅可以用于植物的DNA条形码研究，而且对于动物的DNA条形码研究也具有重要的意义，在中药材的物种鉴定方面具有潜在的研究价值[11-18]。本研究即是利用ITS2序列对威灵仙基源植物及其多种混伪品进行DNA条形码鉴别研究，为该药材的准确鉴定提供分子依据。

1 材料与方法

1.1 材料

材料来源见表1，包括实验样品及来自Genbank下载序列，实验样品经中国医学科学院药用植物研究所林余霖副研究员进行鉴定，凭证标本保存于中国医学科学院药用植物研究所。

表1 材料来源

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

商品药材根使用70%乙醇擦洗表面后研磨，取样约15 mg；植物叶片采用硅胶进行干燥，取样约30 mg，利用植物DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.,China)提取总DNA。

1.2.2 PCR扩增及测序

扩增引物正向为5′-GCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向为5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR体系含MgCl22 μl (25 mm)、dNTP 2 μl (2.5 mm)、PCR buffer 2.5 μl(10×)、引物各1.0 μl (2.5 μm)(Sangon Co., China)、聚合酶1.0 U (Biocolor BioScience & Technology Co., China)、总DNA 约1 μl，共为25 μl的反应体积。扩增程序为94 ℃，5分钟；94 ℃ 30秒，56 ℃ 30秒，72℃ 45秒，40转；72℃ 10分钟。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒(Tiangen Biotech Co., China)回收，纯化后作为测序反应的模板，使用ABI 3730XL 测序仪 (Applied Biosystems Co., USA) 进行双向测序。

1.2.3 数据处理

使用CodonCode Aligner 3.71对测序峰图进行序列拼接，去除引物区，获得ITS2 间隔区序列；使用基于隐马尔可夫模型的HMMer 注释方法对网上数据进行分析，去除两端5.8S和26S区段获得ITS2间隔区序列。用MEGA 4.0软件对所有序列分析比对并进行种内、种间遗传距离的计算。计算基于Kimura 222 Parameter(K2P) 双参数模型。用NJ邻接法(neighbour-2-joining method, NJ)利用比对过的序列构建系统发育树(1000次重复bootstrap检验各分支的支持率)，来直观的鉴定各物种。利用Schultz等建立的ITS2数据库根据Schultz等[16]建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构[19]。

2 结果与分析

2.1 序列比较

威灵仙药材三个基源植物：毛茛科威灵仙Clematischinensis序列长度分别为230 bp，含有三个PolyC和一个PolyG结构，GC含量为69.9%；棉团铁线莲Clematishexapetala序列长度分别为220 bp含有三个PolyC和一个PolyG结构，GC含量为69.5%；东北铁线莲Clematismanshurica序列长度230 bp，含有三个PolyC和一个PolyG结构，GC含量为69.9%。根据Kimura-2参数遗传距离模型计算得到的序列间遗传距离，作为药典收藏威灵仙药材的三个基源品种之间的遗传距离最近，差异最小，威灵仙与棉团铁线莲，距离值为0.006；威灵仙与东北铁线莲，距离值为0.017。金粟兰科的草珊瑚与威灵仙，棉团铁线莲和东北铁线莲之间的遗传距离最远，分别为1.083、1.077和1.146。

2.2 种内分析

以棉团铁线莲为例来分析种内变异的情况，将实验所得数据结合从Genbank中下载的两个ITS2序列作为3个种内参考序列。比对后长度皆230 bp，在151 bp位点的有一个C-G碱基变异位点。此外，有多个缺失位点，分别位于1 bp至5 bp、209 bp、222 bp至230 bp位点。种内平均K2P变异为0.003，种内最大K2P变异为0.005。

2.3 威灵仙及其主要易混伪品ITS2序列种间变异

威灵仙与其主要混伪品ITS2序列间存在较多的变异位点，种间平均K2P距离为0.708。具体种间变异如下图所示：

(图1部分，接下页)

(图1部分，接上页)

图1 威灵仙与其主要混伪品ITS2序列间变异点

2.4 种间聚类分析

本研究发现，ITS2作为DNA条形码序列，在聚类分类图上，威灵仙的三个基源植物聚在一起，可以有效的鉴别威灵仙基源植物与其易混伪品。铁线莲属的6种植物聚集为一枝，支持率到达100%，与其他科属的混伪品，包括草珊瑚、桃儿七、芍药、毛脉菝葜、土茯苓等植物，都能进行很好的区分，差异非常明显。而在铁线莲属的6种植物聚集的一枝中，威灵仙药材正品来源的3种植物聚集为一枝，支持率到达83%，结合枝长方面的信息，非常易于区分威灵仙药材来源的正品植物和其他同属的混伪品种。见图2。

2.5 威灵仙及其主要易混伪品ITS2序列二级结构

如图3所示，威灵仙与其3个混伪品在二级结构上有明显差异。重点差异存在于螺旋Ⅳ中。威灵仙二级结构螺旋Ⅳ基部存在2个小茎环中间有1个中颈环，而毛蕊铁线莲和柱果铁线莲2个物种二级结构螺旋Ⅳ基部的茎环在大小及位置上均与威灵仙存在明显区别。威灵仙二级结构螺旋I和Ⅲ的茎环在数量、大小及位置与芍药存在明显不同。因此，ITS2二级结构也可作为鉴定威灵仙及相近种、伪品的一个方法。

3 讨论

传统的中药材鉴定方法如形态、显微结构、超微结构和化学指纹图谱等鉴定方法，在中药材鉴定和评价其质量研究中发挥了重要作用。但是，中药饮片、粉末以及含有生药原型的传统中成药的鉴定非常困难，采用形态鉴定显然不可取。化学分析方法研究的是植物内的次生代谢产物，而次生代谢产物的含量又受生理条件、采收时间、贮藏等因素的影响，对于化学成分相似的物种就更难以区分因而传统方法有一定局限性。

ITS2序列长度较短，易于扩增，作为ITS一部分，被广泛用于系统进化研究[7,8]，也是药用植物DNA柔形码鉴定最优的序列之一，物种水平的鉴定成功率高达92.7%。在本研究中，ITS2作为DNA柔形码序列可以有效的鉴别威灵仙与其混伪品。

结合三种正品威灵仙的产地来看，威灵仙主要生长于广东、云南、四川、陕西、江苏、安徽等地，棉团铁线莲主要生长于江苏、山东、陕西、内蒙古、辽宁、吉林、黑龙江等地区，东北铁线莲生长于东北三省，以及朝鲜、俄罗斯等地区[20]。综合地区分别来看，体现出一种由南向北，分别生长威灵仙、棉团铁线莲、东北铁线莲的特点，再结合系统聚类树中的枝长信息，在正品威灵仙的单独枝内部，威灵仙与棉团铁线莲聚类为一枝，支持率为64%，且枝长上面，棉团铁线莲更长，而东北铁线莲的枝长长于棉团铁线莲。根据中性理论与“分子钟”理论，结合以上数据，说明并验证了威灵仙最先起始于南方，再向北发展的过程中，为适应不同的环境条件，出现了种间的变异，最终形成了多种威灵仙。资料显示，铁线莲属的分布中心在中国的亚热带地区，在中国范围内云南和四川分布的种类最多(包括变种)，然后以此为中心向四周的分布逐渐减少，Helleboroideae起源中心的推测和铁线莲属古老类群的分布，推测铁线莲属起源于中国西南地区。根据以上分析，本研究结果验证了这一现象[21]。综上所述，ITS2作为DNA条形码序列不仅能够较好的区别中药材威灵仙基源植物与其混伪品，同时，对于探讨威灵仙属不同物种间的进化关系亦能起到重要的参考价值。

图2 基于ITS2序列构建的威灵仙及其混伪品的邻接(NJ)树(bootstrap1000次重复，枝上数值仅显示自展支持率≥50%)

图3 威灵仙及其主要易混伪品ITS2序列二级结构

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