东北地区四种常见禾本科杂草病原真菌资源调查及其致病性测定

何 伟, 邓 晖, 牛永春*, 赵杏利, 高 洁

(1.吉林农业大学农学院,长春 130118; 2.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所,北京 100081)

杂草病原真菌是杂草的天敌,迄今为止,已有很 多用病原真菌防治杂草的成功实例。我国于1963年就用胶孢炭疽菌菟丝子专化型(Colletotrichum gloeosporioides f.sp.cuscutae)开发成为用于防治菟丝子的真菌除草剂“鲁保一号”[1]。1979年用列当镰刀菌(Fusarium orobanches)开发成为防治瓜列当的真菌除草剂“F798”[2]。1981-1982年,真菌除草剂Devine和Collego在美国相继上市[3]。此后有关病原真菌除草方面的研究越来越多。

杂草病原真菌的调查工作将为真菌除草剂的研究开发提供材料和基础。近年来,我国学者在一些地区开展了杂草病原真菌资源的调查。东北地区稗草、狗尾草、马唐和虎尾草等禾本科杂草在农田、草坪和苗木地中广泛分布且危害严重,但有关我国东北地区杂草病原真菌资源调查的报道很少,仅见潘丽梅等报道了东北地区14科26属杂草上的19属41种病原真菌[4],其中仅报道了8种禾本科杂草上的10种真菌,并未开展进一步的研究。对东北地区禾草病原真菌资源的调查,是对我国杂草病原真菌资源的重要补充。作者于2008-2009年对东北地区上述4种禾本科杂草的真菌病害进行了调查,在对所有病害样本进行病菌分离鉴定的基础上进行了部分菌株的致病性测定。

1 材料和方法

1.1 病害调查

于2008年9月中下旬和2009年7月中下旬,分别赴黑龙江省的哈尔滨、尚志和牡丹江,吉林省的长春 、公主岭、吉林、白河、龙井 、松原 、梅河口、四平和通化,辽宁省的大连、辽阳、普兰店、盖州、鞍山、海城和沈阳等县市,对禾本科杂草真菌病害进行调查。调查点类型包括农田、草坪、树林、水沟边、路边和菜地。

1.2 样本采集

在调查禾本科杂草真菌病害过程中,随时采集发病的叶片或茎秆作为样本,并记录寄主名称、采集地点、采集地生境、采集人姓名和采集日期,同时对发病严重的禾本科杂草进行现场拍照记录。对于采集的样本,除进一步对发病部位进行拍照外,注意将样本用吸水纸及时压、晾,使之尽快干燥。

1.3 病原真菌的分离

从病害样本发病部位的病健交界处切取组织块2～5 mm2,用4%(有效氯)次氯酸钠溶液进行表面消毒3～5 min,无菌水漂洗3次,移入PDA培养基平板上,26℃恒温箱中培养。待菌落长出后,从组织块菌落边缘挑取少量菌丝,再次移入PDA平板上培养。经过移植纯化,菌落形态和孢子形态均一致的菌株分别移入PDA斜面培养、保存备用。

1.4 病原真菌的鉴定

1.4.1 形态学观察

将菌株接种在PDA培养基上,26℃恒温培养5 d,记录菌落形态,观察记录孢子形态及产孢结构,测量孢子(20个)和孢子梗大小等,进行详细描述,查阅专著文献进行鉴定。对在PDA平板上不易产孢的菌株,挑取小块菌饼转移至水琼脂平板,15 d后进行显微观察。

1.4.2 rDNA ITS序列比较

在PDA平板上铺玻璃纸,然后把供试菌株接种到玻璃纸上,待菌落接近长满平板时从玻璃纸上收获菌丝体,用CTAB法提取基因组DNA,采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度。

以提取的基因组DNA为模板,用引物 ITS4(5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′)和 ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)对 供试菌株rDNA的ITS区域进行PCR扩增。反应液体积 50 μ L,包括：10×PCR 缓冲液[100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8),500 mmol/L KCl,0.8%Nonidet P-40]5 μ L,25 mmol/L MgCl25 μ L,引物 ITS4(10 μ mol/L)和 ITS5(10 μ mol/L)各 1 μ L,2.5 mmol/L dNTP 2 μ L,5 U/μ L Taq DNA 聚合酶0.4 μ L,基因组 DNA 1 μ L,双蒸灭菌水 34.6 μ L 。PCR反应程序：95℃预变性2 min后,95℃变性1 min,53℃复性1 min,72℃延伸2 min,进行35个循环,最后72℃延伸10 min,4℃保存。PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳分离后,于溴化乙锭溶液(0.5 μ g/mL)中染色 15 min,通过 ALPHA 凝胶成像系统显示记录电泳结果。

PCR扩增产物经检测后送到上海英骏生物技术有限公司测序,测序引物为ITS5。将测得的序列采用BLAST程序与GenBank中的序列进行比较。

1.5 致病性测定

选择一定数量来自严重发病植株的菌株和分离频率较高的属种的代表性菌株,在室内采用人工接种方法进行致病性测定。

1.5.1 植物苗准备

将稗草、狗尾草、马唐和虎尾草的种子分别播种于直径8 cm的花盆中,每盆播15粒种子,每种禾草按每株供试真菌播种3盆。播种后的花盆置于光照培养室内,12 h光照和 12 h黑暗交替,温度为25℃,待小苗2～3叶期时进行接种。

1.5.2 孢子悬浮液制备

将供试菌株转接至PDA平板上,每菌株接4皿,置于25℃培养箱中培养。两周后,用50 mL灭菌水洗下孢子,经双层灭菌纱布过滤,用血球计数板计数,用灭菌水调整孢子悬浮液浓度在1×104～5×105孢子/mL之间,同种菌的不同菌株间孢子浓度差异控制在3倍以内,加入0.1%的吐温-80,混匀备用。

1.5.3 接种

取制备好的孢子悬浮液每菌株80 mL用小型喷雾器喷洒在杂草幼苗叶片上,每菌株接种每种草3盆,以喷洒含0.1%吐温-80的灭菌水作对照。接种后置于封闭容器中保湿24 h,然后置于光照培养室培养。培养室控制在 12 h光照、(28±2)℃和12 h黑暗、(24±1)℃交替,相对湿度30%。

1.5.4 病情记载

接种7 d后调查杂草幼苗发病情况。病情分级记载标准：NS,无症状;LS,有零星病斑;MS,病斑较大,较多;SS,病斑遍布植物叶片,病斑融合,植株死亡[5]。

2 结果与分析

2.1 四种禾本科杂草上的真菌种类

从采自东北地区19个县市4种禾本科杂草病害样本共分离到186个真菌菌株,经鉴定分属于弯孢属(Curvularia)、平脐蠕孢属(Bipolaris)、凸脐蠕孢属(Exserohilum)、茎点霉属(Phoma)、附球霉属(Epicoccum)、小光壳属(Leptosphaerulina)、镰刀菌属(Fusarium)、黑孢属(Nigrospora)、炭疽菌属(Colletotrichum)和链格孢属(Alternaria)等10个属,其中83株分属于10个种[6-10]。不同属真菌的菌株数量具有明显差异,其中链格孢属真菌数量最多,有96株;其次是平脐蠕孢属,有 33株;弯孢属和凸脐蠕孢属分别有23株和20株,其他各属真菌数量比较少。已鉴定到种的真菌中新月弯孢(C.lunata)和麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)分别有20株和18株;狗尾草平脐蠕孢(B.setariae)和尖角凸脐蠕孢(E.monoceras)分别有15株和14株,其他真菌菌株数量相对较少。

新月弯孢、麦根腐平脐蠕孢和链格孢属真菌在4种杂草上均能分离到,除了链格孢属真菌在各种草上出现频率均较高外,稗草上的优势种有新月弯孢、麦根腐平脐蠕孢和尖角凸脐蠕孢,狗尾草上的优势种是狗尾草平脐蠕孢,马唐上的优势种是新月弯孢。而尖角凸脐蠕孢、梭形凸脐蠕孢和刺盘孢属真菌仅在稗草上分离到(表1)。

表1 4种禾本科杂草上分离到的真菌种类和菌株数量

2.2 主要真菌类群的致病性

从鉴定的186株真菌中挑选常见的、分离率较高的4属7种共31个菌株进行了致病性测定。

2.2.1 弯孢属(Curvularia)

对6株新月弯孢(C.lunata)和1株间型弯孢(C.intermedia)的致病性测定结果表明,新月弯孢对4种禾草的致病性均较强且不同菌株对不同禾草的致病性有差异,间型弯孢对4种禾草均无致病性。从虎尾草上分离的3株新月弯孢对稗草和虎尾草致病性均较强,但对马唐无致病性,对狗尾草致病性具有差异性。从马唐上分离的2株新月弯孢对马唐致病性均较强,对其他供试禾草致病性有差异。从狗尾草上分离的1株新月弯孢对狗尾草致病性较强(表2)。

2.2.2 平脐蠕孢属(Bipolaris)

对9株麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)和5株狗尾草平脐蠕孢(B.setariae)进行的致病性测定结果表明,分离自稗草、狗尾草和虎尾草上的麦根腐平脐蠕孢对稗草和狗尾草均具有致病性。分离自狗尾草的狗尾草平脐蠕孢对狗尾草均具有致病性,部分菌株对稗草和虎尾草也具有致病性,总体上对狗尾草的致病性较强。麦根腐平脐蠕孢和狗尾草平脐蠕孢不同菌株间的致病性均有差异,但两种菌对马唐均无致病性(表3)。

表2 弯孢属(Curvularia)真菌对4种禾草的致病性测定结果1)

表3 平脐蠕孢属(Bipolaris)真菌对4种禾草的致病性测定结果1)

2.2.3 凸脐蠕孢属(Exserohilum)和链格孢属(Alternaria)

致病性测定的凸脐蠕孢包括2株嘴突凸脐蠕孢E.rostratum、3株梭形凸脐蠕孢E.f usif orme和3株尖角凸脐蠕孢E.monoceras,结果表明,它们对马唐均无致病性,对虎尾草无致病性或仅有轻微致病性。除1株分离自马唐的嘴突凸脐蠕孢对4种草均无致病性外,其他分离自稗草的菌株对稗草或狗尾草均有不同程度的致病性。梭形凸脐蠕孢和尖角凸脐蠕孢对稗草的致病性均比对狗尾草的致病性强,而嘴突凸脐蠕孢对稗草无致病性。2株分离自狗尾草的链格孢对狗尾草均具有致病性(表4)。

表4 凸脐蠕孢属(Exserohilum)和链格孢属(Alternaria)真菌对4种禾草的致病性测定结果1)

2.3 重要病原真菌的鉴定及形态特征

2.3.1 新月弯孢[Curvularia lunata(Wakker)Boedijn]

形态特征(参考菌株HW08194-4)：分生孢子梗长,分生孢子褐色,常具3个离壁隔膜,中间隔膜薄,且颜色深,大多数孢子从基部起第3细胞处最大且弯曲,孢身平滑,孢子大小(17.1～ 24.4)μ m×(7.3～12.2)μ m。分子鉴定：经对 rDNA ITS序列在NCBI上进行BLAST比对,从发病稗草、马唐和虎尾草上分离的新月弯孢菌株与GenBank中Curvularia lunata(登录号：FJ040177.1)相似性均为100%。

寄主：稗草、马唐、虎尾草、狗尾草。

稗草上的症状：叶片病斑不规则形,灰白色,边缘深褐色。马唐上的症状：叶片病斑梭形,中间浅褐色,边缘深褐色,叶片边缘和中部均有分布。虎尾草上的症状：叶片病斑圆形,黑色,密布于叶片。狗尾草上的症状：初期病斑梭形,褐色,后期病斑中间灰白色,边缘深褐色。

采集地点：黑龙江哈尔滨和牡丹江;吉林龙井、长春、四平、吉林、公主岭、通化。

2.3.2 麦根腐平脐蠕孢[Bipolaris sorokiniana(Sacc.)Shoemaker]

形态特征(参考菌株HW08196-2)：在PDA培养基于28℃培养7 d后,菌落直径为7.0～8.6 cm,菌落正面灰色、绒毛状,背面黑褐色,边缘波浪形或不规则形。分生孢子梗黄褐色,多数直,偶尔微弯,单生,未见分支,直径2.4～6.1 μ m。分生孢子暗褐色,椭圆形或拟纺锤形,直或稍弯,中部宽,两端略细,顶端钝圆,表面平滑,有3～12个假隔膜,大小(61.1～78.1)μ m×(19.3～22)μ m。分子鉴定：经对 rDNA ITS序列在NCBI上进行BLAST比对,从发病稗草和狗尾草上分离的麦根腐平脐蠕孢菌株与GenBank中Bipolarissorokiniana(登录号：EU030351.1)相似性分别为100%和99%。

寄主：稗草、狗尾草。

稗草上的症状：发病初期叶片上散布梭形褐色小斑,后期病斑扩展,梭形、深褐色病斑密布叶片。狗尾草上的症状：病斑长梭形,中部灰白色,边缘深褐色。

采集地点：黑龙江尚志、牡丹江;吉林长春、龙井、四平、吉林、梅河口和白河。

2.3.3 尖角凸脐蠕孢[Exserohilum monoceras(Drechsler)Leonard&Suggs]

形态特征(参考菌株HW08177-3)：分生孢子梗单生或簇生,直或弯曲,有时上部呈膝曲状,具隔膜,平滑,深褐色,宽4.9～7.3 μ m。分生孢子浅褐色至深褐色,拟纺锤形,平滑,直或弯曲,4～10个假隔膜,(66～100.2)μ m ×(14.7～19.6)μ m,平均90.5 μ m ×17.5 μ m,脐点明显突出。分子鉴定 ：经对rDNA ITS序列在NCBI上进行BLAST比对,从发病稗草上分离的尖角凸脐蠕孢菌株与GenBank中的Setosphaeria monoceras(尖角凸脐蠕孢的有性阶段,登录号：DQ337380.1)相似性为98%。

寄主：稗草、狗尾草。

症状：发病初期在叶片两面或叶鞘上形成褐色小斑点,后扩展成长椭圆形或梭形大斑,病斑边缘灰白色,有时茎秆上也形成褐色斑。

采集地点：吉林长春、公主岭、梅河口和四平。

2.3.4 梭形凸脐蠕孢(Exserohilum f usi f orme Alcorn)

形态特征(参考菌株172-2)：在PDA平板上,菌落灰褐色,中央隆起,气生菌丝发达,边缘整齐,背面褐色。菌丝无色或淡褐色,光滑或略粗糙,具隔膜,多分枝,宽3～6 μ m。分生孢子梗单生或簇生,直或略弯曲,端部常随产孢呈屈膝状,淡褐色,光滑,2～8个隔膜,宽4.9～7.3 μ m。分生孢子顶侧生,棕黄色,梭形,多数中部最宽,两端渐窄,5～8个假隔膜,(78.2～139.3)μ m ×(17.1 ～ 22)μ m,平 均 112.4 μ m ×18.7 μ m,脐点凸出明显。分子鉴定：经对 rDNA ITS序列在NCBI上进行BLAST比对,从发病稗草上分离的梭形凸脐蠕孢菌株与GenBank中Exserohilum f usi forme(登录号：AF163063.1)相似性为98%。

寄主：稗草、狗尾草。

症状：发病初期,叶片分布大量梭形褐色小斑,后期病斑扩展为大的长梭形或椭圆形褐色病斑。

采集地点：黑龙江尚志;吉林长春和松原。

2.3.5 狗尾草平脐蠕孢[Bipolarissetariae(Sawada)Shoemaker]

形态特征(参考菌株HW08233-2)：在PDA培养基上28℃下培养7 d,菌落直径6.4～7.0 cm,灰白色,絮状,菌落背面灰褐色。在PDA培养基上不易产孢,在水琼脂培养基上易产孢。菌丝黄褐色,有分支,分生孢子梗多单生,直立或稍弯曲,宽3.6～4.9 μ m。分生孢子稍弯曲,很少直立,拟纺锤形或梭形,淡色至褐色,平滑,5～10个假隔膜,(48.9～97.8)μ m ×(12.2～ 14.7)μ m。分子鉴定：经对 rDNA ITS序列在NCBI上进行BLAST比对,从发病狗尾草上分离的狗尾草平脐蠕孢菌株与GenBank中Bipolaris setariae(登录号：EF452444)的相似性为100%。

寄主：狗尾草、虎尾草、稗草。

症状：病斑梭形,深褐色,有的病斑中间灰白色、边缘深褐色,病斑在叶片中间和边缘均有分布。

采集地点：黑龙江哈尔滨;吉林长春、龙井、四平;辽宁普兰店和辽阳。

3 讨论

关于新月弯孢(C.lunata)对稗草和马唐的致病性研究已有报道[11-12],本研究明确了该菌除对稗草和马唐外,对狗尾草和虎尾草也可引起病害。耿锐梅等[13]从云南感病稗草上分离到麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)并对其生防潜力进行了评价,本研究明确了该菌在狗尾草上也可引发病害。关于狗尾草平脐蠕孢(B.setariae),张猛等[14]从河南农田感病狗尾草、赵杏利等[5]从北京、河北、河南和青海的发病狗尾草和其他3种禾草上都分离到该菌。本研究从东北三省的发病狗尾草和虎尾草分离到该菌多个菌株,表明狗尾草平脐蠕孢是狗尾草及其他一些禾草的重要病菌。赵杏利等的结果和本研究结果都表明,狗尾草平脐蠕孢对狗尾草致病性较强,不同菌株其致病性存在差异。用尖角凸脐蠕孢来防除稗草是国内外研究的热点,日本正在商品化生产中[15]。菲律宾研究者[16]也对稗草上分离到的尖角凸脐蠕孢进行了深入研究,目前的难点是孢子生产和适宜剂型。国际水稻所与加拿大 McGill大学[17-19]合作研究尖角凸脐蠕孢,正与有关公司合作进行商品化生产。本研究除获得引起稗草病害的尖角凸脐蠕孢外,还发现梭形凸脐蠕孢(E.f usiforme)也可引起稗草发病。

对于新病害、研究较少或不熟悉的病害,分离培养和人工接种对于确定植物病害的病原菌是非常必要的。本研究将野外调查和分离培养、人工接种相结合,在初步明确我国东北地区4种常见禾本科杂草稗草、狗尾草、马唐和虎尾草上的真菌种类的基础上,经人工接种确定了一些真菌的致病性及在不同禾草上所致病害的症状,明确了稗草上的主要病菌有新月弯孢、麦根腐平脐蠕孢、尖角凸脐蠕孢和梭形凸脐蠕孢,狗尾草上的主要病菌有新月弯孢、狗尾草平脐蠕孢和麦根腐平脐蠕孢,马唐和虎尾草上的病菌主要有新月弯孢。研究结果丰富了用于控制杂草的病菌资源和信息,为真菌除草剂的研发奠定了基础。

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