Plant MetGen MAP数据库分析水稻表达谱芯片数据的方法初探

刘 峙, 刘 莉, 付月灵, 张文蔚, 简桂良, 齐放军

(中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193)

随着生物信息学的快速发展和功能基因组学的兴起,许多DNA内在的信息需要我们去注释。这就需要处理大量的信息,包括大规模的DNA序列解析、比对以及基因功能的鉴别等[1]。基因芯片技术正是满足了这种需求,才得以快速发展。Fodor等首先提出了DNA芯片的概念[2]。经过十多年的发展,该技术已逐渐发展成熟并获得广泛应用。近年来,基因芯片已应用于水稻基因表达谱的分析[3-5]。科学地解读基因芯片数据,才能将数据结果与生命活动联系起来,进而阐明基因表达与生命活动的规律。

Plant MetGenMAP是美国康奈尔大学Boyce ThoMpson植物研究所开发的一个在线分析系统,可以分析大量的基因表达数据,并揭示基因表达量、代谢途径及生命活动的变化情况[6]。本研究以A ffymetrix的表达谱芯片的数据为例,利用 Plant MetGenMAP数据库,对水稻受病原菌侵染后基因表达量及代谢途径的变化进行了初步的分析,为分析基因芯片数据提供了一种新方法。

1 材料与方法

1.1 水稻的培养

选择饱满一致的水稻(Oryzae sativa Linn.cv.Nipponbare)种子,用质量分数5%H2O2消毒30 min,蒸馏水冲洗数次,放入26℃恒温培养箱中催芽3 d。选择发芽一致的种子播于盛有营养土的塑料盆中,放入光照培养箱,在28℃/16 h光照,24℃/8 h黑暗,湿度为75%的条件下培养。培养至三叶期接种。

1.2 菌株的培养

挑取水稻白叶枯病菌JxoI(Xanthomonas oryzae pv.oryzae;JxoI)、非寄主病原菌Xv5(X.caMpestrispv.vesicatoria;Xv5)的单菌落,分别培养于4 ML LB液体培养基中,28℃,200 r/min,培养48 h,取1ML培养液加入到50ML LB液体培养基中,28℃,200 r/min,培养6 h至对数生长期。

1.3 喷雾接种和样品采集

培养好的菌液浓度调至108cfu/ML,喷雾接种水稻,以喷清水作对照。接种后的水稻置于饱和湿度、30℃、暗光条件下培养。

接菌24 h后取样。采集接菌后的水稻叶片,迅速用液氮冻存,-80℃保存。

1.4 总RNA提取

水稻叶片总 RNA提取采用热酚法[7],乙醇洗涤、干燥,得到 RNA样品。

1.5 芯片测试

各处理的RNA样品委托博奥生物芯片公司,用A ffyMetrix水稻全基因组芯片,进行表达谱的测试。

1.6 Plant MetGenMAP数据库分析

所采用的水稻A ffymetrix芯片检测结果数据如表1所列。本研究以3组A ffymetrix表达谱检测结果Jxo I vs清水、Xv5 vs清水及Jxo I vs Xv5为对象,分析A ffymetrix表达谱芯片的数据。Jxo I vs清水表示喷清水的水稻为对照材料,接种Jxo I的水稻为试验材料,进行两两比较,从而得到基因表达量的变化倍数。Xv5 vs清水、Jxo I vs Xv5代表含义与此类同。登录 Plant MetGenMAP(http：∥bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/MetGenMAP/home.cgi),将3组(Jxo I vs清水、Xv5 vs清水及Jxo I vs Xv5)试验数据上传至Plant MetGenMAP数据库。该试验数据的格式为文本文档格式,内容包括探针编号(如OS.53924.1.S1_at)及该基因表达量的变化倍数(fold change)。利用该数据库分析各组数据的测试结果。

表1 Affymetrix芯片检测结果

2 数据分析结果

2.1 基因表达量的变化情况

在3组试验中,基因表达量的变化情况见表2。以表达量上调2倍及以上(fold change≥2)的基因为表达量显著上调的基因,表达量下调2倍及以上(fo ld change≤-2)的基因为表达量显著下调的基因。

表2 基因表达量的变化

2.2 PlantMetGenMAP数据库分析结果

2.2.1 代谢途径的变化情况

利用Plant MetGenMAP中“changed pathway”分析功能,可以分析3组试验中水稻代谢途径的变化情况。从表3中可以发现,水稻受白叶枯病菌Jxo I及非寄主菌Xv5侵染后,代谢途径的变化存在显著差异。白叶枯病菌JxoI引起的表达量下调的代谢途径数量多于上调的数量,而非寄主菌Xv5引起的表达量上调的代谢途径数量远多于下调的数量。这大致反映了白叶枯病菌JxoI与水稻发生亲和性互作,与防卫反应相关的代谢途径主要受到抑制,而非寄主菌Xv5与水稻发生非亲和性互作,与防卫反应相关的代谢途径主要被激活的状况。

表3 代谢途径变化情况

利用Plant MetGenMAP数据库,还可以分析某一代谢途径中各个基因表达量的变化情况。以水杨酸合成途径为例,在JxoI vs清水中,水杨酸合成途径上调表达,其中1个基因表达量上调2倍以上,5个基因表达量在0～2倍之间;在Xv5 vs清水中,水杨酸合成途径也上调表达,其中1个基因表达量上调2倍以上,2个基因表达量在0～2倍之间。具体的变化情况见图1,图中黑色图框表示该基因表达上调2倍以上,灰色图框表示该基因表达量在0～2倍之间。通过比较发现,OS.10930.1.S1_at探针标记的基因(LOC_Os02g41670)在两组试验中表达量均上调2倍以上(在JxoI vs清水中上调2.52倍,在Xv5 vs清水中上调3.01倍)。由PlantMetGenMAP注释信息得知,该基因(LOC_Os02g41670)编码苯丙氨酸解氨酶,参与苯基丙酸类合成途径起始阶段(phenylpropanoid biosynthesis,initial reactions)、水杨酸合成途径(salicylate biosynthesis)及软木脂合成途径(suberin biosynthesis),在应答外界胁迫及刺激等生命活动中发挥作用。这一分析结果与苯丙氨酸解氨酶在植物抗病过程中发挥的作用完全一致。在植物防卫反应次生代谢途径中,苯丙烷类代谢途径起着十分重要的作用,可形成一些次生抗病物质,如植保素、木质素等,而苯丙氨酸解氨酶是这一途径的关键酶和限速酶[8-15]。这一结果说明利用PlantMetGenMAP数据库可以准确地分析水稻抗病代谢途径的变化情况及关键的调控基因。

图1 水杨酸合成途径各基因表达变化情况示意图

2.2.2 Gene Ontology分析

利用PlantMetGenMAP数据库中GeneOntology(GO)分析功能,以JxoI vs清水为例,进行聚类分析,检查基因的富集情况,分类依据为差异基因构成的细胞组分(cellu lar components)及参与的生物学过程(biological process)。在JxoI vs清水中,差异基因的富集情况见图2。基因富集分析揭示了差异基因在各个细胞组成中的表达情况及参与的生物学过程。通过GO分析差异基因的富集情况,有助于更好地了解水稻受病原菌侵染后,基因表达的变化规律。例如,在本例中,通过GO进行聚类分析,发现水稻受白叶枯病原菌JxoI侵染后,差异表达的基因多是参与新陈代谢过程(metabolic process)、细胞过程(cellular process)、应答刺激(response to stimulus和 abiotic stimulus)等。这为我们进一步研究水稻与病原菌互作的分子机制、探寻水稻抗/感病分子机理、发掘新的抗病基因奠定了基础。

3 讨论

基因芯片技术已经广泛应用在水稻基因组的研究中。相对于几种传统的用于检测基因表达水平的方法,如 RT-PCR、Northern杂交、MRNA 差别显示等,高通量检测是基因表达谱芯片的优势。基因表达谱芯片可以平行检测众多基因的表达情况,有助于全面了解植物在特殊处理、环境因子影响、发育阶段、病原菌侵染等条件下较为完整的基因表达情况。通过与样本对照,分析与特定事件相关的基因,进而确定相应基因的功能或多个基因间的协同作用[5]。而对于基因表达谱芯片的解读是这些研究的关键所在。

图2 JxoI vs清水差异基因富集图

基因芯片数据分析是解读基因芯片数据的关键。目前,可以分析基因表达量变化情况、代谢途径变化情况,并且进行GO(Gene Ontology)分析的数据库有很多,如博奥生物公司采用的MAS(molecule annotation system)系统,GenMAPP分析软件等。但这些分析工具有着明显的不足之处,如MAS系统目前只能提供代谢途径的网状图,而无法显示代谢途径中基因表达量的变化情况;GenMAPP目前提供的数据库多是哺乳动物的数据库,明显缺少植物物种,适用于哺乳动物的研究。而Plant MetGenMAP数据库适用于拟南芥、水稻、番茄基因芯片的分析,并且可以将基因表达量的变化情况与代谢途径的改变情况结合在一起进行分析,结果简洁直观,为进一步研究基因功能和代谢途径提供了方便。

本文利用A ffymetrix全基因组芯片测试结果,通过Plant MetGenMAP数据库,初步分析了水稻受白叶枯病菌JxoI、非寄主菌Xv5侵染后基因表达的变化以及代谢途径的改变情况,分析结果直观、清晰明了,这为进一步发掘水稻抗病基因、研究水稻抗病防卫反应信号通路、揭示水稻抗/感病分子机制奠定了基础。同时,提供了一种利用Plant MetGen-MAP数据库分析基因芯片数据的方法。

[1]Case-Green SC,Mir K U,Pritchard C E,et al.Analyzing genetic info rMation with DNA arrays[J].Current Opinion in Chemical Biology,1998,2：404-410.

[2]Fodor S P,Read J L,Pirtung MC,et al.Ligh t-directed,spatially addressable parallel cheMical syn thesis[J].Science,1991,251(4995)：767-773.

[3]王颖妲,邓其明,李平.基因芯片技术在水稻研究中的应用[J].中国农学通报,2006,22(8)：55-59.

[4]韩庆典,陈志伟,段远霖,等.利用基因芯片检测水稻细菌性条斑病抗性相关基因[J].分子植物育种,2008,6(2)：239-244.

[5]张津津,严成其,金志华,等.基因芯片技术在水稻研究中应用进展[J].浙江农业学报,2008,20(4)：308-311.

[6]Joung JG,Corbett A M,Fellman SM,et al.Plant MetGen-MAP：an integ rative analysis systeMfor plant systems biology[J].Plant Physiology,2009,151：1758-1768.

[7]BacheMCW B,Oomen R JF J,Visser RG F.Transcript imaging with cDNA-AFLP：a step-by-step protocol[J].Plant Molecular Biology Reporter,1998,16：157-173.

[8]丁秀英,张军,苏宝林,等.水杨酸在植物抗病中的作用[J].植物学通报,2001,18(2)：163-168.

[9]曾勇三,王振中.苯丙氨酸解氨酶在植物抗病反应中的作用[J].仲恺农业技术学院学报,1999,12(3)：56-65.

[10]K lessig D F,Du rner J,Noad R,et al.Nitric oxideand salicylic acid signaling in plan t defense[J].PNAS,2000,97(16)：8849-8855.

[11]W hite F F,Yang B.H ost and pathogen factors controlling the rice-Xanthomonas oryzae interaction[J].Plan t Physiology,2009,150：1677-1686.

[12]H ammond-Kosack K E,Jones JDG.Resistance gene-dependent plant defense responses[J].The Plan t Cell,1996,8：1773-1791.

[13]Dixon RA,Paiva N L.Stress-indu ced pheny lpropanoidmetabolism[J].The Plant Cell,1995,7：1085-1097.

[14]Yang Y,Qi M,Mei C S.Endogenous salicylic acid p rotects rice plan ts fromoxidative damage caused by aging as well as biotic and abiotic stress[J].The Plant Jou rnal,2004,40：909-919.

[15]Li Z K,A rif M,Zhong D B,et al.Complex genetic netw orks underlying the defensive systeMof rice(Oryza sativa L.)to Xan thomonasoryzae pv.oryzae[J].PNAS,2006,103(21)：7994-7999.