影响降解菌W2修复异草酮污染土壤的三种因子的优化

刘亚光, 刘 蕊, 唐广顺

(东北农业大学农学院,哈尔滨 150030)

影响降解菌W2修复异草酮污染土壤的三种因子的优化

刘亚光, 刘 蕊, 唐广顺

(东北农业大学农学院,哈尔滨 150030)

[目的]确定降解菌W2对土壤中异噁草酮的最优生物修复条件。[方法]采用3因素5水平正交旋转组合设计,室外盆栽生物测定方法,研究降解菌W2接种量、土壤含水量和肥料添加量3种田间可控因子对降解菌W2修复异噁草酮污染土壤效果的影响。[结果]确定修复条件的优化数学回归模型为:y=62.363 9+5.872 8×C1-4.494 1×C2C3-1.262 1×C21-4.076 7×C22,不同因子对土壤修复影响大小顺序依次为土壤含水量、肥料添加量、降解菌W2接种量。[结论]降解菌W2对土壤中异噁草酮的最优生物修复条件为:降解菌W2接种量 8.19～11.81 mL/kg(A650=0.4),土壤含水量18.6%～20.84%,肥料添加量1.83～2.52 g/kg。在此范围内降解菌W2对异噁草酮有效成分浓度为500 μ g/kg的风干土壤30 d后的降解率可达60%以上,可接近该修复天数的理论极值65.56%。

异噁草酮; 降解菌W2; 降解率

异噁草酮是20世纪80年代FMC研制的有机杂环类选择性苗前除草剂,抑制敏感植株叶绿素和类胡萝卜素的合成,防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草效果显著[1-3],可广泛应用于大豆、棉花、甘蔗、玉米、烟草等作物田[2,4]。异噁草酮在土壤中的生物活性长达16个月,在水中残留为130 d以上,自然降解速度缓慢,其长残留性不仅对后茬作物小麦、油菜、甜菜、向日葵以及多种蔬菜产生残留药害,亦影响到作物地周围水生生物生长[5],严重地影响了种植业结构的调整和生态安全[6]。此类除草剂在土壤中不易发生光降解和水解,对土壤微生物和土壤酶活性有促进作用[7],其降解主要依靠微生物活动[8-9]。

2005年,本课题组从长期施用异噁草酮的黑土中分离出可高效降解该除草剂的降解菌W2,前期试验得出在异噁草酮浓度500 μ g/kg风干土,田间持水量40%的条件下,接种20 mL/kg W2菌后降解半衰期为27.5 d,相比未接种土壤缩短63.9%[10]。该降解菌适应力强,在温度20～37℃、pH6.0～9.0范围内均生长良好[1]。国内外对异噁草酮的研究主要集中在除草机制、选择性机制、代谢降解机理、安全性及与其他农药的配合作用等[3,5-6],异噁草酮微生物降解的研究以及对异噁草酮降解菌应用条件的摸索除了本课题组外还未见报道。影响生物修复效果的因素主要是被降解农药的种类和浓度、微生物群体的活性和环境因子[11]。而自然环境错综复杂,很多自然因素(温度、土壤类型等)不可控,优化可控因素能够大幅度提高降解菌的降解效果[12-13]。土壤中的自然微生物无法迅速有效地降解土壤中污染物的情况下需要进行人工接种[14],作用效果显著[15-16]。接菌量的多少势必会影响该菌群在土壤中的生活力,刘亚光等[17]研究发现接种量对降解菌Y1降解土壤中异噁草酮有很大影响。并且,向土壤中添加肥料不仅可以为降解菌提高碳源和能源,也可以促进土壤呼吸[18],加快对异噁草酮的降解,前期试验表明添加无机肥料效果好于有机肥料[12]。而土壤含水量和土壤呼吸呈线性相关[19],必然会影响W2菌的降解效果,且水分作为农药运输扩散的溶剂对微生物的降解也有很大影响[20]。

本试验拟对W2菌做进一步应用性研究。根据田间实际情况,利用生物测定方法,通过二次正交旋转组合设计优化降解菌接种量、土壤含水量和肥料添加量3种田间可控因素,确定降解菌W2的最优生物修复条件,为异噁草酮降解菌剂应用于田间实际条件,最终解决异噁草酮的后茬危害问题,奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

降解菌W2(短杆菌属Brevibacterium),为本课题组从东北农业大学香坊农场长期施用异噁草酮的试验田中分离出的具有降解异噁草酮作用的需氧型细菌菌株,东北农业大学农学院农药与杂草教研室提供。培养基:牛肉膏 5 g,蛋白胨5 g,琼脂 18 g,NaCl 5 g,蒸馏水1 L,pH7.0～7.2。

1.2 供试材料

供试药品:异噁草酮(clomazone)480 g/L乳油,美国富美实公司。

供试作物:玉米,品种为‘东农250’。

供试仪器:RXZ型智能人工气候箱,宁波江南仪器厂;超净工作台,上海浦东跃欣科学仪器厂。

供试土壤:采自东北农业大学香坊园艺站附近荒地(未施药)。土壤为黑土,其理化性质如下:pH6.75,有机质含量 4.17%,全氮 0.185%,全磷0.546%,碱解氮 1.55 mg/kg,速效氮 0.955 mg/kg,速效钾2.359 mg/kg。

供试肥料:通用性复合肥料,总养分含量 ≥45%,N 、P2O5、K2O 的比例为 12∶18∶15,黑龙江倍丰农业生产资料有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 建立异噁草酮含量生物测定标准曲线

异噁草酮通过抑制植株体内类胡萝卜素和叶绿素的合成来抑制光合作用导致植株死亡[2]。本试验采用玉米土培法[21]测定叶片叶绿素含量,建立土壤中异噁草酮浓度与叶绿素含量抑制率之间的标准曲线。第7天测叶绿素含量,建立标准曲线。异噁草酮有效成分浓度为 1～50 μ g/kg 时:y=-4.776 4x-0.676 2(R2=0.932 6);有效成分浓度 50 ～ 1 000 μ g/kg时:y=37.063x-172.75(R2=0.972 8)。

1.3.2 异噁草酮降解菌W2最佳修复条件的研究

3因素5水平正交旋转组合设计见表1。

表1 试验因素水平编码表

降解菌W2浓度为A650=0.4。向风干土中添拌异噁草酮,按试验设计,同时混拌降解菌、肥料和无菌水,使土壤中异噁草酮有效成分浓度为500 μ g/kg(等同田间有效施用量600 g/hm2)。土壤盆装(上口径8 cm×下口径5.5 cm×高11 cm),上覆保鲜膜,置于温室中,每2 d测量土壤湿度并及时补无菌水。培养 15、30、45、60、90 d后分别取土样,参照玉米土培法[21],播种已催芽的玉米,每试验重复4次,人工气候箱中光暗交替(12 h∥12 h)培养。第7天测玉米叶绿素含量,根据标准曲线计算土壤中异噁草酮的含量。

1.3.3 数据分析

微生物对异噁草酮的降解率=(初始浓度-处理后残留浓度)×100%/初始浓度。

应用DPS数据系统软件对试验数据进行方差分析,并用origin对旋转回归进行谱图分析。

2 结果与分析

2.1 三元二次回归方程的建立及检验

图1所示,降解菌W2对异噁草酮的修复效果在0～90 d内随着时间的延长修复的效果越好,90 d时降解率最高可达90.41%,且3个处理之间差异不显著。处理8与处理1和0水平相比,降解率值虽略低,但降解均呈上升趋势,且3个处理在30 d的时候,降解速度增幅最快,由13.59%、7.01%、27.15%升至 62.93%、41.37%、62.42%,差异显著。本试验选择30 d作为修复时间,不仅具代表性且有利于试验的展开。如表2,以30 d的降解率进行回归分析,建立数学模型并对方程进行F检验、t检验,将回归模型优化为:

试验中各因素贡献率分别为 ΔC1=0,ΔC2=2.246 667,ΔC3=2.091 225,由此可知 3个因素对降解率影响大小顺序依次为:土壤含水量、肥料添加量、降解菌接种量。

图1 降解菌W2对异噁草酮的降解效果

表2 降解率试验结果(30 d)

2.2 单因素降维分析

当其中2个因素水平分别都取-1,0,1时,分析第3个因素与异噁草酮降解率的关系。以试验因素编码号为横坐标,以降解率为纵坐标,降维分析后得曲线如图2所示。

图2(a)可以看出,当其他2个因素固定时,W2菌接种量的提高,对降解效果没有明显的影响。充分说明降解菌W2在土壤中的适应能力好,生长繁殖速度快,对异噁草酮降解效果相差不大。图2(b、c)可知,适度提高土壤含水量和外源肥料均可促进W2菌对异噁草酮的降解效果,但土壤含水量超过22.5%、肥料添加量超过2.5 g/kg,降解效果略有降低。

2.3 双因素降维分析

根据数据绘制土壤含水量(%),肥料添加量(g/kg),接菌量(mL/kg)中双因素交互作用时对降解率(%)影响的曲面图。如图3系列所示。

如图3(a)所示,土壤含水量固定时,适度提高肥料添加量可显著促进W2菌对异噁草酮的降解,且在土壤含水量为18.75%时达最高点。当肥料添加量固定于某一水平下时,W2菌对异噁草酮的降解效果随着土壤含水量的增加呈先促进后抑制。图3(b)所示,肥料添加量固定,接菌量的多少对异噁草酮的降解效果影响不明显,同单因素试验结果相同;接菌量固定,适度提高肥料用量,降解效果呈明显上升趋势。图3(c)所示,当土壤含水量处于某一水平时,接菌量的增加,变化不明显;接菌量固定时,适度土壤含水量提高,降解效果可明显升高。因此,可少量施用降解菌W2,适当提高土壤含水量和肥料的用量,即可明显促进对异噁草酮的降解。

2.4 模型的优化分析

对模型进行优化,求出理论极值。

ymax=65.56%,此时各因素的对应编码值为(0,0,1),即C1(W2菌接种量)=10 mL/kg,C2(土壤含水量)=18.75%。C3(肥料添加量)=2.5 g/kg。

ymin=14.76%,此时各因素的对应编码值为(-1.682,-1.682,-1.682),即C1(W2菌接种量)=1.6 mL/kg,C2(土壤含水量)=12.45%。C3(肥料添加量)=1.16 g/kg。

2.5 修复条件的优化和验证

利用频数分析方法寻找最优生物修复条件,其中大于60%的方案共有45个,频数分析结果列于表3。

表3 降解率模型频数分析

由表3可知,95%置信区间30 d后降解率超过60%的降解条件为接菌量8.19～11.81 mL/kg,土壤含水量18.6%～20.84%,肥料添加量1.83～2.52 g/kg。用45 d的数据对模型进行验证,95%置信区间45 d后降解率超过71%的降解条件为接菌量8.95～11.09 mL/kg,土壤含水量17.9%～19.56%,肥料添加量1.89～2.11 g/kg,与 30 d回归模型结果相符。

3 结论与讨论

试验通过优化可控自然因素来保证并提高降解菌修复异噁草酮污染土壤的效果。得到了异噁草酮降解菌W2生物修复条件的优化数学回归模型y=62.363 9+5.872 8×C1-4.494 1×C2C3-1.262 1×C21-4.076 7×C22,此模型在试验范围内能较准确地预测降解菌W2对土壤中异噁草酮的降解率。在接种量1.6～18.4 mL/kg,土壤含水量12.45%～25.05%,肥料添加量1.16～2.84 g/kg范围内,土壤含水量对降解率的影响作用最大,其次是外源肥料。土壤含水量在该范围内可保证除草剂在土壤中的运输及与降解菌的接触几率;但土壤含水量不能过高,否则将导致土壤含氧量降低,影响需氧菌W2的呼吸机制,进而影响降解效果。东北土壤含水量年均值22%[22],具冬季最高,夏季次之,春秋偏低的特点,可根据土壤含水量的大小综合考虑确定施用降解菌的最适时期。外源肥料的添加不仅可以促进土壤呼吸[18],同样可以促进土壤微生物的恢复,提高降解菌对污染物的降解活性,张超兰在研究外源物质影响土壤微生物对甲磺隆和莠去津污染土壤的快速降解问题得到相同结论[13]。区别于其他学者得出的土壤中农药降解率与接菌量呈正相关的结论[15,23],本试验中接菌量的增减与降解率之间的相关性不明显,表明W2菌的群体适应力强,生长繁殖迅速,可有效降解残留的异噁草酮,并且需要额外的碳源和能源来满足生长,确保降解微生物的持续繁殖。所以,适度提高土壤含水量和肥料添加量即可显著促进降解菌W2对异噁草酮的降解效果。

降解菌对土壤中异噁草酮的最优生物修复条件:降解菌W2接种量 8.19～11.81 mL/kg(A650=0.4),土壤含水量 18.6%～20.84%,肥料添加量1.83～2.52 g/kg。在此范围内降解菌W2对异噁草酮有效成分浓度为500 μ g/kg(等同田间有效施用量600 g/hm2)的风干土壤30 d后的降解率可达60%以上,可接近该修复天数的理论极值65.56%。修复90 d后的效果将更好。该菌适应能力强,在北方偏干的土壤中仍可有效降解异噁草酮。唐广顺[12]在异噁草酮有效成分浓度为700 μ g/kg,土壤含水量18.75%条件下接种10 mL/kg降解菌W2,90 d后玉米生长接近正常水平。

本研究最终目的是应用于生产实践,而将降解菌制成微生物肥料不但有利于其在田间传播,而且菌、肥同时施用也简化了农业操作,效果良好[24]。本试验设置3个可控因素进行二次正交旋转组合设计,优化生物修复条件,确定最优生物修复范围,为下一步W2菌肥的研制和田间实际应用奠定了基础,为最终解决异噁草酮的后茬危害问题,提供了相应的理论依据。

[1]刘亚光,闫春秀,赵滨.降解除草剂异噁草酮细菌的分离、鉴定及生长特性[J].中国油料作物学报,2007,29(3):328-332.

[2]Kaňa R, Š pundová M,Ilík P,et al.Effect of herbicide clomazone on photosynthetic processes in primary barley(Hordeum vulgareL.)leaves[J].Pesticide Biochemistry and Physiology,2004,78(3):161-170.

[3]Yurdagul Ferhatoglu,Michael Barrett.Studies of clomazone mode of action[J].Pesticide Biochemistry and Physiology,2006,85(1):7-14.

[4]白鹤,赵振,丁伟,等.异噁草酮及其生物降解的研究进展[J].东北农业大学学报,2009,40(8):128.

[5]Denise dos Santos Miron,Alexandra Pretto,Márcia Crestani,et al.Biochemical effects of clomazone herbicide on piava(Leporinus obtusidens)[J].Chemosphere,2008,74(1):1-5.

[6]Rodrigo Figueroa,Marcelo Kogan.Clomazone selectivity among six cucurbit crops[J].Agrociencia,2005,39(6):611-618.

[7]刘亚光,李洁,唐广顺.异噁草酮对土壤微生物和土壤酶活性的影响[J].植物保护,2010,36(3):85-88.

[8]M ervosh T L,Sims G K,Stoller E W.Clomazone fate in soil as affected by microbial activity,temperature,and soil moisture[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1995,43(2):537-543.

[9]David Gara P M,Bosio G N,Arce V B,et al.Photoinduced degradation of the herbicide clomazone model reactions for naturaland technical systems[J].Photochemistry and Photobiology,2009,85(3):686-692.

[10]闫春秀.异噁草酮降解细菌的筛选及其降解效果研究[D].哈尔滨:东北农业大学农学院,2005.

[11]刘娜,杨云龙.生物修复技术在污染环境修复中的应用研究[J].科技情报开发与经济,2005,15(3):173-175.

[12]唐广顺,刘亚光.影响土壤中异噁草酮生物修复效果的因子研究[J].东北农业大学学报,2008,39(5):53-57.

[13]张超兰.外源物质对除草剂污染土壤微生物生物量及除草剂快速降解的影响研究[D].杭州:浙江大学环境与资环学院,2003.

[14]沈德中.污染环境的生物修复[M].第1版.北京:化学工业出版社,2002:163.

[15]黄星,潘继杰,孙纪全,等.降解菌S113对甲磺隆污染土壤生物修复作用的研究[J].土壤学报,2008,45(1):150-154.

[16]Castillo M A,Felis N,Aragón P,et al.Biodegradation of the herbicide diuron by streptomycetes isolated from soil[J].International Biodeterioration and Biodegradation,2006,58(3-4):196-202.

[17]刘亚光,李洁,唐广顺.影响降解菌Y1降解土壤中异噁草酮的三种因素的优化[J].中国农业科学,2010,43(12):2453-2459.

[18]SmithV R.Moisture,carbon and inorganic nutrient controls of soil respiration at a sub-Antarctic island[J].Soil Biology and Biochemistry,2005,37(1):81-91.

[19]Cook F J,Orchard V A.Relationships between soil respiration and soil moisture[J].Soil Biology and Biochemistry,2008,40(5):1013-1018.

[20]A shim Chowdhury,Saswati Pradhan,Monidipta Saha,et al.Impact of pesticides on soil microbiological parameters and possible bioremediation strategies[J].Indian Journal of Microbiology,2008,48(1):114-127.

[21]刘亚光,杨谦.长残留除草剂广灭灵生物测定方法的研究[J].东北农业大学学报,2005,36(4):463-466.

[22]张晓影.中国区域土壤湿度特性分析及评估[D].北京:中国地质大学水资源与环境学院,2009.

[23]赵野.土壤中乙草胺降解菌的筛选与主要影响因子研究[D].重庆:西南大学植物保护学院,2008.

[24]李自刚,王新民,刘太宇,等.复合微生物菌肥对怀地黄连作障碍修复机制研究[J].湖南农业科学,2008(5):62-65.

Optimization of threefactors affecting clomazone degradation in contaminated soils by degrading bacteria W2

Liu Yaguang, Liu Rui, Tang Guangshun
(College of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin150030,China)

[Objective]To optimize the conditions for clomazone degradation in contaminated soils by degrading bacteria W2.[Method]Three factors affecting degradation rate were studied,including the soil moisture content,the amount of inoculation and fertilizer used.Based on the bioassay method,the degradation rates of bacteria W2under different conditions were compared by using orthogonally rotational combination design.[Result]Mathematical regression model for clomazone degradation was established as follows:y=62.363 9+5.872 8×C1-4.494 1×C2C3-1.262 1×C21-4.076 7×C22.The results demonstrated that the significance order affecting degradation rate was:the soil moisture content,the amount of fertilize used and the amount of inoculation.[Conclusion]When the amount of inoculation ranged from 8.19 mL/kg to 11.81 mL/kg,soil moisture content ranged from 18.6%to 20.84%,and the amount of fertilizer used ranged from 1.83 g/kg to 2.52 g/kg,the degradation rate was above 60%in air-dried soils containing 500 μ g/kg clomazone after 30 days,close to the highest degradation rate 65.56%.

clomazone; degrading bacteria W2; degradation rate

S 154;S 482.47

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.03.020

2010-04-13

2010-08-23

黑龙江省自然科学基金项目(C2007-20);大豆生物学省部共建教育部重点实验室开放基金项目(SB08B03)

联系方式 E-mail:liuyaguang@sina.com