筋脉通胶囊对糖尿病大鼠阴茎组织一氧化氮合成酶表达的影响

朴元林 梁晓春 吴群励 孙连庆 屈岭 王普艳 赵丽

近年来的临床研究证实神经病变在糖尿病勃起功能障碍的发病中起着非常重要的作用[1，2]。已有研究表明糖尿病病人及糖尿病模型动物的阴茎组织中神经型一氧化氮合成酶(nNOS)表达减低，提示存在勃起神经损害[3，4]。本课题组既往研究发现中药筋脉通胶囊能够改善糖尿病周围神经病变，提高糖尿病周围神经病变患者及链尿佐菌素诱导的糖尿病(STZ-DM)大鼠的坐骨神经的神经传导速度，增加STZ-DM大鼠周围神经组织的神经生长因子mRNA转录及其蛋白的表达[5]，具有神经保护作用。本研究采用STZ-DM大鼠模型，观察筋脉通对其阴茎组织NOS表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8～9周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠，体重230～265 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：京2007-0001。

1.2 实验药物和试剂

筋脉通胶囊(由菟丝子、女贞子、桂枝、水蛭、元胡、细辛等药物组成)，为中国医学科学院北京协和医院院内制剂，由北京九龙制药厂加工生产，每粒含生药0.35 g，批准文号(97)京卫药制加字[48]第F-292 号，生产批号061019。链脲佐菌素(STZ)购自Calbiochem公司。神经妥乐平(NEUT)购自日本脏器制药株式会社，每片含4NU，批准文号S20040071，生产批号06180。兔抗鼠nNOS单克隆抗体购自abcam公司，批号ab76067；iNOS兔抗鼠多克隆抗体，AGEs兔抗鼠多克隆抗体及3,3二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自博士德公司。

1.3 动物模型的建立和分组干预

60只雄性Wistar大鼠，适应性喂养1周后，随机取其中10只为正常组。禁食12小时后按60 mg/kg一次性腹腔内注射0.45%的STZ溶液(pH 4.2)，72小时后测血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病造模成功。将糖尿病模型大鼠再随机分为模型组、筋脉通小剂量组、筋脉通中剂量组、筋脉通大剂量组及神经妥乐平组，每组各10只。成模后即开始灌胃给药，每日1次，连续16周。筋脉通小、中及大剂量组分别按成人剂量的5倍、10倍及20倍(即0.4375 g·kg-1·d-1、0.875 g·kg-1·d-1及1.75 g·kg-1·d-1)给药，NEUT组以成人剂量的10倍即2.67 nU·kg-1·d-1给药。正常组和模型组按0.01 ml/g每日灌喂蒸馏水。

1.4 体重及血糖检测

每4周取大鼠尾尖血，以罗氏快速血糖测定仪和血糖试纸条测定血糖，每次测血糖前均称体重。

1.5 标本处理

所有实验大鼠于灌胃第16周末处死。用12%乌拉坦10 ml/kg腹腔注射麻醉后，俯卧位固定，取中段阴茎组织, 置于10%中性甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,待查免疫组化染色。

1.6 免疫组化染色及检测方法

免疫组化染色采用EnVision法，使用Dako Cytomation免疫组化自动染色机进行染色。

免疫组织化学染色步骤：切片厚度4 μm，68℃烤片45分钟；三步二甲苯脱蜡,每步15分钟；进无水酒精；进3%H2O2溶液室温孵10分钟；梯度酒精水化(无水，95%，80%)，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，5分钟×3次；滴加一抗(兔抗鼠多克隆AGEs抗体或兔抗鼠nNOS单克隆抗体，稀释比例1∶100)，4℃过夜，PBS冲洗，5分钟×3次；滴加稀释比例1∶200二抗生物素化的羊抗兔IgG，EnVision室温孵育45分钟，PBS冲洗，5分钟×3次；DAB 显色；苏木精复染；常规脱水、透明、封片。

阴茎平滑肌细胞胞质及神经纤维被染为棕黄色为阳性。通过Nikon Eclipse 80i显微镜、微视Mcv2000 图像采集系统, 采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件,对免疫组织化学结果进行分析。每组各随机取8只大鼠,每只大鼠观察2张切片,每张切片在200倍光镜下选取5个互不重叠视野,测量每个视野的累积吸光度(IOD) ,各取均值为1只大鼠的结果,然后进行统计分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况、血糖及体重

与正常大鼠比，糖尿病模型大鼠的血糖明显升高、体重明显下降；糖尿病大鼠各组之间的血糖及体重无显著性差别，具体结果参见本课题组既往的研究报道[5]。

2.2 nNOS及iNOS免疫组化染色分析

2.2.1 nNOS免疫组织化学结果

光镜下观察，nNOS阳性染色的神经纤维散在分布，呈棕黄色。与正常组比较，模型组、神经妥乐平组、筋脉通小剂量组和筋脉通大剂量组的IOD数值明显减低(P<0.01)。与正常组比较，筋脉通中剂量组的IOD数值，无显著性差异(P>0.05)。模型组、神经妥乐平组、筋脉通小剂量组和筋脉通大剂量组，各组之间的IOD数值比较无显著性差异(P>0.05)。与模型组比较，筋脉通中剂量组的IOD数值显著升高，具有统计学意义(P<0.01)。与神经妥乐平组比较，筋脉通中剂量组的IOD数值显著升高(P<0.01)。见表1。

2.2.2 iNOS免疫组织化学染色结果

光镜下观察，iNOS阳性染色的阴茎平滑肌细胞胞质呈棕黄色，各组间IOD数值比较差异无统计意义(P>0.05) 。见表1。

表1 各组大鼠阴茎组织nNOS、iNOS表达IOD值比较

3 讨论

一氧化氮(NO)及其介导的平滑肌松弛是阴茎勃起过程中的重要环节[6]。性刺激时，阴茎海绵体内非肾上腺素非胆碱能神经末梢和血管内皮细胞在NOS的催化下合成并释放NO。NO活化胞质内可溶性鸟苷酸环化酶，后者把鸟嘌呤三磷酸(GTP)转化为环鸟苷磷酸(cGMP)，cGMP激活蛋白激酶G，降低平滑肌细胞胞质内钙离子浓度，从而引起平滑肌松弛。研究发现1型糖尿病动物由电刺激引发的海绵体松弛功能已出现障碍,提示存在非肾上腺素非胆碱能神经损害[7],而在2型糖尿病人及2型糖尿病大鼠中均已证实阴茎组织中nNOS表达减低[3,4]。

糖尿病勃起功能障碍即中医消渴病兼证“阳痿”。气阴两虚、肾虚血瘀是消渴病阳痿的主要中医病机。笔者在临床观察到糖尿病ED病人以阴虚证、血瘀证和气虚证为多见，随着病程延长阳虚证及血瘀证表现加重、勃起功能越差[8]。筋脉通是由菟丝子、女贞子、水蛭、元胡、桂枝、细辛等组成,其中菟丝子和女贞子温阳育阴、平补肾之阴阳；元胡和水蛭活血化瘀；桂枝、细辛温经通脉。全方配伍具有补肾活血、温经通脉之功，符合消渴病阳痿中医病机。

本研究发现糖尿病大鼠阴茎组织nNOS的表达降低，筋脉通可以明显提高糖尿病大鼠阴茎组织nNOS的表达。本课题组既往研究表明，筋脉通可抑制多元醇代谢途径的激活、抗氧化应激、减少核因子κB的表达、上调神经生长因子及睫状体神经生长因子的表达、减少非酶糖基化终末产物(AGEs)的生成并下调AGEs受体异常表达，具有保护糖尿病周围神经组织结构、促进神经的修复与再生作用[5，9-15]。因此，推测筋脉通升高糖尿病大鼠阴茎组织nNOS表达可能与其多途径多靶点的神经保护作用有关。

本研究观察到筋脉通改善糖尿病大鼠阴茎组织nNOS表达降低的作用，并非浓度依赖。本课题组以往的研究[5]也观察到筋脉通的作用呈非浓度依赖的情况，有待进一步的药代动力学与药效学研究。通常认为，诱导型的NOS(iNOS)在细胞应激时表达，并在病理生理条件下表达升高[16]。有研究发现糖尿病模型大鼠的阴茎海绵体iNOS mRNA的表达升高，提示糖尿病引起的海绵体内应激增加[17]。本研究的各组之间的iNOS表达无明显差别，有待将来的更进一步研究。

总之，筋脉通能提高糖尿病大鼠阴茎组织nNOS表达，可能有助于改善糖尿病勃起功能障碍，有待进一步的相关实验研究。

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