心房肽Ⅲ对离体大鼠心脏缺血再灌注损伤的保护作用

刘永欣 曹东平 刘奎甲 吴超 彭应心

自1981年，De Bold发现心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)以来，人们对 ANP进行了大量研究。Ma等［1］研究表明，急性心肌梗死患者给予冠状动脉(冠脉)再灌注治疗后，血浆ANP释放增加。据推测，ANP释放增加可能是对心肌的一种保护作用。心房肽Ⅲ(atriopeptinⅢ，APⅢ)是ANP的一种，保存了ANP的功能结构。本文以APⅢ为代表，研究ANP对离体大鼠心脏缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 取健康雄性SD大鼠，体重250～300 g。腹腔内注射肝素，150 U/100 g，15 min后击昏，迅速开胸，取心脏，立即置于0℃冷K-H灌流液中，使其停跳。在液面下经主动脉断端行主动脉逆行插管，以线结扎固定，立即开始灌流。心脏自然灌流平衡30 min，符合下列条件的心脏入选:(1)心率(HR)＞230次/min;(2)冠脉流量7～11 ml。

1.2 方法 共选取36个心脏，随机分成6组，每组6个:(1)正常对照组。(2)模型组。(3)维拉帕米组:给药时阳性对照组浓度1×10－7mol/L。(4)APⅢ高剂量实验组:给药时APⅢ浓度1×10－7mol/L。(5)APⅢ中剂量实验组:给药时APⅢ浓度3×10－8mol/L。(6)APⅢ低剂量实验组:给药时APⅢ浓度1×10－8mol/L。除正常对照组持续灌流90 min外，其余各组均停灌30 min，复灌60 min。复灌时，各用药组均先采用含药物的K-H液灌注15 min后，换用不含药物的K-H液灌注。Ⅲ:购自Calbiochem公司，纯度＞97%，批号:90817-13-3。

Langendroff离体心脏恒压灌流装置，温度维持在37℃。灌流液为Krebs-Henseleit液(K-H液)。灌流前，配制新鲜 K-H液，通含95%O2和5%CO2的混合气体10 min使其饱和，测pH值为7.4。灌流过程中持续低流量通气。

1.3 检测和观察指标 (1)测定冠脉流出液乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性;(2)测定心肌组织SOD活性和丙二醛MDA的含量。

2 结果

2.1 APⅢ对冠脉流出液SOD、LDH的影响 模型组冠脉流出液中SOD活性显著低于正常对照组(P＜0.01)。给予3种剂量的APⅢ和维拉帕米，灌流液中SOD活性均高于模型对照组(P＜0.05)，各给药组差异无统计学意义(P ＞0.05)。模型组冠脉流出液中LDH的释放高于正常对照组(P＜0.01)。给予3种剂量的APⅢ和维拉帕米后，灌流液中LDH活性均低于模型组，但差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表1。

2.2 APⅢ对心肌组织SOD、NO浓度及MDA含量的影响 模型组心肌组织SOD活性显著低于正常对照组(P＜0.01)。给予3种剂量APⅢ和维拉帕米，心肌组织SOD活性均显著高于模型对照组(P＜0.01)。APⅢ各剂量组与维拉帕米组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。MDA测定结果显示，模型组心肌组织MDA含量显著高于正常对照组(P＜0.01)。高、中剂量APⅢ组MDA含量低于模型组(P＜0.05);低剂量APⅢ组和维拉帕米MDA含量低于模型组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。APⅢ各剂量组与维拉帕米组MDA含量差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表2。

3 讨论

氧化应激是机体受到有害因素作用后的共同反应机制。SOD、MDA是反应氧化应激的重要指标。SOD是人体天然的自由基清除酶，其活性高低直接影响自由基的平衡。MDA是氧自由基与生物膜多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的产物，其产生量与氧自由基的量相平行，间接反映出细胞损伤的程度［2］。

表1 APⅢ对冠脉流出液SOD、LDH的影响

表1 APⅢ对冠脉流出液SOD、LDH的影响

注:与模型组比较，*P＜0.05;与正常对照比较，#P＜0.01

组别 SOD(NU/ml) LDH(U/L)14.5±1.0 164±82模型组 8.3±2.0# 605±207#维拉帕米组 11.6±2.8* 398±220 APⅢ高剂量实验组 12.1±2.4* 358±260 APⅢ中剂量实验组 12.0±3.1* 455±209 APⅢ低剂量实验组 11.3±2.5*正常对照组486±257

表2 APⅢ对心肌组织SOD浓度及MDA含量的影响

表2 APⅢ对心肌组织SOD浓度及MDA含量的影响

注:与正常对照组比较，*P＜0.01;与模型组比较，#P＜0.05，△P＜0.01

分组 SOD(NU/g protein) MDA(mmol/g protein)289±42 1.8±0.4模型组 145±22* 2.8±0.5*维拉帕米组 201±29△ 2.1±0.6 APⅢ高剂量实验组 223±47△ 1.9±0.5#APⅢ中剂量实验组 216±43△ 2.1±0.5#APⅢ低剂量实验组 182±11△正常对照组2.1±0.7

心肌缺血再灌注损伤的病理过程与氧化应激密切相关［3］。由于缺血再灌时产生大量氧自由基(OFR)。消耗SOD，产生MDA，损伤心肌组织。本实验发现，APⅢ能显著提高缺血再灌注心肌以及灌流液中SOD的活性，减少心肌MDA的含量，说明APⅢ能有效对抗氧化应激，保护缺血再灌注心肌。

APⅢ能有效对抗氧化应激，其机制可能与APⅢ降低胞浆内Ca2+含量有关［4］。细胞膜上ANP受体实际上是鸟苷酸环化酶的一种膜形式，ANP与受体结合后，激活鸟苷酸环化酶，细胞内 cGMP水平升高，又可进一步激活G-激酶，G-激酶可促进细胞膜上钙泵的转运，使细胞内Ca2+外流;又可抑制钙通道，减少Ca2+内流。G-激酶还可抑制肌浆网内储存Ca2+的释放。而OFR产生和钙超载在心肌缺血再灌注损伤中互相促进。因此，在缺血再灌注中，APⅢ可能通过抑制再灌注时细胞内钙超载，减少氧自由基的形成，对抗氧化应激，减轻心肌组织的再灌注损伤。

总之，APⅢ能够减少心肌缺血再灌注中SOD的消耗和MDA的产生，保护心肌组织，并且有剂量依赖性。LHD是心肌坏死标志物，冠脉流出液中，漏出减少差异无统计学意义，可能主要是由于未能达到标本检测所须的精确度，使检测结果离散度过高所至。

1 Ma XJ，Yin HJ，Chen KJ，et al.Appraisal of the prognosis in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention.Chin J Integr Med，2009，15:236-240.

2 Madamachi NR，Vendrov A，Rungs MS，et al.Oxidative stress and vascular disease.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25:29-38.

3 Lorgis L，Zeller M，Dentan G.The free oxygen radicals test(FORT)to assess circulating oxidative stress in patients with acute myocardial infarction.Atherosclerosis，2010，213:616-621.

4 De Vito P，Incerpi S，Pedersen JZ，et al.Atrial natriuretic peptide and oxidative stress.Peptides，2010，31:1412-1419.